Thermostable Enzymes in Lignocellulose Hydrolysis
- 作者
- Liisa Viikari, Marika Alapuranen, Terhi Puranen, Jari Vehmaanperä, Matti Siika-aho
- 单位
- University of Helsinki, P.O. Box 27, 00014 Helsinki, Finland; ROAL, Valta-akseli, 05200 Rajamäki, Finland; VTT Technical Research Centre of Finland, P.O. Box 1000, 02044 Espoo, Finland
- DOI
- 10.1007/10_2007_065
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素酶水解中，现有商业纤维素酶热稳定性差，需在较低温度（45-50°C）下操作，导致水解效率低、酶用量大。开发耐热纤维素酶混合物以提高水解温度、降低酶用量并改善过程经济性。
研究策略
从嗜热真菌中克隆三种耐热纤维素酶（纤维二糖水解酶Cel7A、内切葡聚糖酶Cel45A、β-葡萄糖苷酶Cel3A），在里氏木霉中表达并优化比例，另添加耐热木聚糖酶；在高温（55-60°C）下对蒸汽预处理云杉和玉米秸秆进行水解，与商业酶制剂对比性能。
核心内容
针对商业纤维素酶热稳定性差、需在低温下水解导致效率偏低的问题，研究者从嗜热真菌中克隆了三种耐热纤维素酶（纤维二糖水解酶Cel7A、内切葡聚糖酶Cel45A、β-葡萄糖苷酶Cel3A）及一种耐热木聚糖酶，并在里氏木霉中异源表达，构建了仅含3至4种组分的简化酶系。该酶系在55至60°C下对蒸汽预处理云杉和玉米秸秆进行水解，与商业制剂对比。结果显示，耐热酶混合物在60°C下可达约90%的理论水解率，与商业酶在45°C时的效果相当；其FPU活性在65°C时比商业酶在60°C时高约25%。在云杉底物上，55°C和60°C下水解率分别约为商业酶的3倍和5倍；在玉米秸秆上，72小时葡萄糖产率达理论值的90%至95%，木糖产率为80%至90%。实验表明，仅由四种耐热酶组成的混合物即可优于含至少十种酶的商业制剂，将操作温度提高10至15°C，显著提升比活力并减少酶用量，展现了改善木质纤维素水解过程经济性的潜力。
创新点
构建了仅由3-4种克隆耐热酶组成的简化水解酶系，替代商业复合酶；水解温度可提高约10-15°C；新型酶在65°C时最大FPU活性比商业酶在60°C时高约25%；在含木聚糖底物中加入耐热木聚糖酶显著提升水解效果。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichoderma reesei | 纤维素水解 | cel7A | CBH/Cel7A（来源于Thermoascus aurantiacus，融合T. reesei CBHI CBM） | 催化 | 耐热纤维二糖水解酶，从还原端水解纤维素链，包含纤维素结合域。 |
| Trichoderma reesei | 纤维素水解 | cel45A | EG/Cel45A（来源于Acremonium thermophilum） | 催化 | 耐热内切葡聚糖酶，随机切割纤维素链。 |
| Trichoderma reesei | 纤维素水解 | cel3A | BG/Cel3A（来源于Thermoascus aurantiacus） | 催化 | 耐热β-葡萄糖苷酶，将纤维二糖水解为葡萄糖。 |
| Trichoderma reesei | 半纤维素水解 | — | 木聚糖酶（家族10，来源于Thermoascus aurantiacus） | 催化 | 耐热木聚糖酶，水解底物中残留的木聚糖。 |
| Trichoderma reesei | 纤维素和半纤维素水解 | cbh1启动子 | — | 调控 | 使用强启动子cbh1控制耐热酶基因的表达，宿主菌株敲除了主要纤维素酶基因（Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A）。 |
关键发现
- 耐热酶混合物在60°C下可获得约90%理论水解率（以单糖计），与商业酶在45°C的效果相当
- 新型酶混合物FPU活性在65°C时比商业酶在60°C时高约25%
- 水解温度可提高10-15°C
- 在云杉底物上，55°C和60°C下耐热酶水解率分别约为商业酶的3倍和5倍
- 在玉米秸秆上，72h水解后葡萄糖产率达理论值的90-95%，木糖产率为80-90%（温度最高60°C）
- 在Avicel上60°C时，耐热酶水解率比商业酶高约3-4倍。
研究结论
克隆的耐热酶在初步优化的配方中可显著改善木质纤维素水解，仅由四种耐热酶组成的混合物即可优于含至少十种酶的商业T. reesei制剂；可在55-60°C（商业酶为45-50°C）下稳定操作，明显提高比活力并减少蛋白用量，具有改善过程经济性的潜力。