Enabling Technologies to Advance Microbial Isoprenoid Production

作者: Yun Chen, Yongjin J. Zhou, Verena Siewers, Jens Nielsen
单位: Systems and Synthetic Biology, Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology
杂志: Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology（2014）
DOI: 10.1007/10_2014_284
所属领域: 代谢工程
关键词: E. coliEnabling technologiesMetabolic engineeringS. cerevisiaeSesquiterpenesTerpenoids
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解决的核心问题

微生物生产异戊二烯类化合物面临效率低、商业化难的问题，需要开发高效细胞工厂。

研究策略

综述并总结多种使能技术，包括基因发现、DNA组装、途径模块化、空间优化、辅因子工程、计算与组学辅助、发酵过程设计等，强调设计-构建-测试循环。

研究路线图

核心内容

该文系统综述了推动微生物异戊二烯类化合物生产的多种使能技术，涵盖基因发掘、DNA组装、途径模块化、空间优化、辅因子工程、计算与组学辅助以及发酵过程设计等，强调设计-构建-测试循环在细胞工厂开发中的核心作用。作者整合了合成生物学工具，如多元模块途径工程、蛋白融合与支架、线粒体靶向区室化、动态调控启动子及计算模型指导等策略。关键结果包括：酵母中工程菌产青蒿酸达25 g/L，大肠杆菌两相发酵产amorphadiene达27 g/L，酵母中达40 g/L；模块化途径工程使taxadiene产量达1 g/L，较对照提高约15000倍；蛋白支架使mevalonate产量提高77倍，线粒体靶向使valencene和amorphadiene分别提高8倍和20倍；辅因子工程使amorphadiene提高50%，靶向蛋白质组学鉴定瓶颈酶后产量再增3倍。异戊二烯最终达到60 g/L，产率2 g/L/h。这些结果表明，多种使能技术的组合可显著提升微生物异戊二烯生产效率，但距离商业化广泛应用仍需进一步优化与集成。

创新点

系统总结了代谢工程和合成生物学中的最新工具和方法，如多元模块途径工程、蛋白融合与支架、线粒体靶向区室化、动态调控启动子、计算模型指导等。

研究对象（23）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli	MEP pathway	dxs	1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase	催化	MEP途径模块优化中的关键酶
Escherichia coli	MEP pathway	ispD	2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase	催化	MEP途径模块优化中的关键酶
Escherichia coli	MEP pathway	ispF	2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase	催化	MEP途径模块优化中的关键酶
Escherichia coli	MEP pathway	idi	isopentenyl diphosphate isomerase	催化	MEP途径模块优化中的关键酶
Escherichia coli	MVA pathway	tHMG1	HMG-CoA reductase	催化	异源表达酵母MVA途径，NADH依赖型变体提高amorphadiene产量50%
Saccharomyces cerevisiae	MVA pathway	tHMG1	HMG-CoA reductase	催化	截短形式过表达，增强前体供应
Saccharomyces cerevisiae	MVA pathway	ERG20	farnesyl diphosphate synthase	催化	FPP合酶，过表达增加FPP供应
Saccharomyces cerevisiae	sterol biosynthesis	ERG9	squalene synthase	催化	下调以减少FPP向甾醇的分流
Saccharomyces cerevisiae	MVA pathway	UPC2-1	Upc2p transcription factor	调控	突变体，上调MVA途径基因表达
Saccharomyces cerevisiae	acetyl-CoA metabolism	ADH2	alcohol dehydrogenase 2	催化	过表达以增加乙酰-CoA供应
Saccharomyces cerevisiae	acetyl-CoA metabolism	ALD6	aldehyde dehydrogenase 6	催化	过表达以增加乙酰-CoA供应
Saccharomyces cerevisiae	acetyl-CoA metabolism	ACS	acetyl-CoA synthetase	催化	来自鼠伤寒沙门氏菌的变体，提高乙酰-CoA水平
Saccharomyces cerevisiae	glutamate metabolism	GDH1	NADPH-dependent glutamate dehydrogenase	催化	删除以增加NADPH可用性
Saccharomyces cerevisiae	glutamate metabolism	GDH2	NAD+-dependent glutamate dehydrogenase	催化	过表达以改善辅因子平衡，提高cubebol产量85%
Saccharomyces cerevisiae	artemisinic acid biosynthesis	CYP71AV1	cytochrome P450 monooxygenase	催化	来自植物，与酵母工程结合产青蒿酸25 g/L
Escherichia coli	artemisinin precursor biosynthesis	—	P450BM3	催化	来自Bacillus megaterium，底物杂泛性，用于催化环氧化
Saccharomyces cerevisiae	diterpene biosynthesis	SmCPS	labdadienyl/copalyl diphosphate synthase	催化	与SmKSL融合提高miltiradiene产量
Saccharomyces cerevisiae	diterpene biosynthesis	SmKSL	kaurene synthase-like	催化	与SmCPS融合提高miltiradiene产量
Saccharomyces cerevisiae	sesquiterpene biosynthesis	—	patchoulol synthase	催化	与FPP合酶融合，patchoulol产量提高约2倍
Saccharomyces cerevisiae	acetyl-CoA metabolism	CIT2	peroxisomal citrate synthase	催化	删除以消除乙酰-CoA消耗
Saccharomyces cerevisiae	acetyl-CoA metabolism	MLS1	cytosolic malate synthase	催化	删除以消除乙酰-CoA消耗
Escherichia coli	MVA pathway	MK	mevalonate kinase	催化	靶向蛋白质组学鉴定为瓶颈，调节后amorphadiene提高3倍
Escherichia coli	MVA pathway	PMK	phosphomevalonate kinase	催化	靶向蛋白质组学鉴定为瓶颈

关键发现

在酵母中工程化菌株产青蒿酸达25 g/L
在E. coli中两相发酵产amorphadiene达27 g/L，酵母中达40 g/L
模块化途径工程使taxadiene产量达1 g/L，比对照提高约15000倍
蛋白支架使mevalonate产量提高77倍
RNA支架使氢产量提高约50倍
线粒体靶向使valencene和amorphadiene产量分别提高8倍和20倍
删除GDH1和过表达GDH2使cubebol提高85%
辅因子工程使amorphadiene产量提高50%
靶向蛋白质组学鉴定MK和PMK为瓶颈，调节后amorphadiene提高3倍
双相提取发酵中柠檬烯的MIC提高约700倍
异戊二烯生产达到60 g/L，产率2 g/L/h，得率11%。

研究结论

通过组合多种使能技术，微生物异戊二烯生产取得了显著进展，但仍有待进一步发展以实现商业化的广泛应用。

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