Isoprenoid Drugs, Biofuels, and Chemicals—Artemisinin, Farnesene, and Beyond
- 作者
- Kevin W. George, Jorge Alonso-Gutierrez, Jay D. Keasling, Taek Soon Lee
- 杂志
- Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/10_2014_288
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用合成生物学和代谢工程手段在微生物宿主中高效生产异戊二烯类化合物，包括药物青蒿素和多种先进生物燃料前体（如法尼烯、双桧烯、柠檬烯、蒎烯、异戊烯醇等）
研究策略
系统综述异戊二烯生物合成途径（MVA和MEP）的工程改造，重点介绍在E. coli和S. cerevisiae中组装异源MVA途径、平衡酶表达（TIGR、蛋白支架、靶向蛋白组学）、动态调控（压力响应启动子）、发酵过程优化及化学-生物合成杂合路线等策略
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了利用合成生物学和代谢工程在微生物宿主中高效生产异戊二烯类化合物的策略，涵盖药物青蒿素前体及多种生物燃料前体（法尼烯、双桧烯、柠檬烯、蒎烯等）。主要做法包括在E. coli和S. cerevisiae中组装异源甲羟戊酸（MVA）途径，并通过TIGR、合成蛋白支架、靶向蛋白组学等手段平衡酶表达，采用压力响应启动子实现动态调控，同时结合发酵过程优化和化学-酶法杂合路线。关键结果为：在E. coli中重构MVA途径后，amorphadiene产量从最初112 mg/L逐步优化至27.4 g/L，在酵母中经进一步改造达41 g/L，青蒿酸达25 g/L（较早期提高10倍以上）；法尼烯在工业酵母中产量高达104.3 g/L，生产率16.9 g/L/d。动态调控策略使amorphadiene产量较诱导型启动子提高2倍。该工作表明，通过途径平衡和动态调控，异戊二烯类化合物的微生物生产已接近工业化水平，半合成青蒿素已实现产业化，为其他萜类产物的大规模生物制造提供了可推广的技术范式。
创新点
总结从青蒿素项目中发展出的多种代谢工程工具（如TIGR、合成蛋白支架、SRM蛋白组学、动态调控启动子）并将其推广到倍半萜、单萜和半萜生物燃料前体的生产中；强调化学-酶法结合生产生物燃料
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | atoB | 乙酰-CoA硫解酶（AtoB） | 催化 | 来自E. coli，MVA途径第一步，将乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，N端截短以减轻HMG-CoA积累，改善生长并提高甲羟戊酸产量3倍 |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，磷酸化甲羟戊酸生成甲羟戊酸-5-磷酸 |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，磷酸化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-二磷酸 |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | PMD | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，ATP驱动脱羧消除生成IPP |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | idi | IPP异构酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli | 异源甲羟戊酸（MVA）途径 | ispA | 法尼基二磷酸合酶（FPP合酶） | 催化 | 来自E. coli，缩合IPP和DMAPP生成FPP |
| Escherichia coli | 青蒿素生物合成途径 | ADS | 无菑二烯合酶（Amorphadiene synthase） | 催化 | 来自A. annua，催化FPP环化生成无菑二烯 |
| Escherichia coli | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 CYP71AV1 | 催化 | 来自A. annua，催化无菑二烯依次氧化生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸 |
| Escherichia coli | 青蒿素生物合成途径 | CPR | NADPH:细胞色素P450氧化还原酶 | 催化 | 来自A. annua，为CYP71AV1提供电子 |
| Escherichia coli | 青蒿素生物合成途径 | ALDH1 | 青蒿醛脱氢酶 | 催化 | 来自A. annua，催化青蒿醛氧化为青蒿酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇/异戊二烯生物合成途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 下调或抑制以减少FPP向甾醇分支的碳流 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以提高FPP前体供给，工程菌中整合3拷贝 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成调控 | UPC2 | 转录因子UPC2 | 调控 | 过表达激活甾醇合成基因，增加FPP通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖利用与基因表达调控 | GAL80 | 半乳糖调节子的负调控因子 | 调控 | 敲除后无需半乳糖诱导，可用葡萄糖作碳源 |
| Escherichia coli | MEP（DXP）途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | MEP途径限速步骤，催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP |
| Escherichia coli | MEP（DXP）途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | 将DXP转化为MEP |
| 多种微生物宿主（E. coli / S. cerevisiae） | 倍半萜生物合成（FPP下游） | farnesene synthase | 法尼烯合酶 | 催化 | 来自A. annua或P. abies等，催化FPP生成法尼烯 |
| 多种微生物宿主（E. coli / S. cerevisiae） | 倍半萜生物合成（FPP下游） | bisabolene synthase | 双桧烯合酶 | 催化 | 来自Abies grandis，催化FPP生成双桧烯，其氢化产物双桧烷是柴油替代物 |
| 多种微生物宿主（E. coli / S. cerevisiae） | 单萜生物合成（GPP下游） | limonene synthase | 柠檬烯合酶 | 催化 | 催化GPP生成柠檬烯，氢化后可作为喷气燃料添加剂 |
| 多种微生物宿主（E. coli / S. cerevisiae） | 单萜生物合成（GPP下游） | pinene synthase | 蒎烯合酶 | 催化 | 催化GPP生成α-蒎烯或β-蒎烯，其二聚体氢化后具有高体积能量密度 |
| Escherichia coli | 半萜（异戊烯醇）生物合成 | nudF | Nudix水解酶NudF | 催化 | 来自B. subtilis，可将IPP转化为异戊烯醇，缓解IPP毒性并生成生物燃料 |
| Escherichia coli | 半萜（异戊烯醇）生物合成 | yhfR | YhfR磷酸酶 | 催化 | 来自B. subtilis，同样可转化IPP生成异戊烯醇并恢复细胞生长 |
关键发现
- 文中报道的关键产量数据：在E. coli中重构MVA途径后，amorphadiene产量最初为112 mg/L（LB+0.8%甘油），后经优化达到480 mg/L，进一步改造达到27.4 g/L
- 在S. cerevisiae中通过过表达tHMGR和UPC2、下调ERG9，amorphadiene产量为153 mg/L，青蒿酸115 mg/L
- 经进一步优化，amorphadiene产量达41 g/L（碳摩尔收率16.98 Cmol%），青蒿酸产量达25 g/L（比早期提高>10倍）
- 法尼烯在工业酵母PE-2中产量达104.3 g/L，生产率16.9 g/L/d，回收率95%
- 在E. coli中表达A. grandis双桧烯合酶可产双桧烯约400 mg/L，优化前体途径后达900 mg/L，在酵母中通过基因敲除和途径优化产量提高20倍以上至800 mg/L（摇瓶）和5.2 g/L（发酵）
- 法尼醇在E. coli中达135 mg/L，在S. cerevisiae中达约5 g/L（215 h补料分批）
- 异戊烯醇通过nudF等基因可将IPP转化为异戊烯醇
- 此外，与使用诱导型启动子相比，动态调控使amorphadiene产量提高2倍（约1.5 g/L）。
研究结论
异戊二烯类化合物是药物和先进生物燃料的重要来源，微生物合成生物学和代谢工程已成功实现了包括青蒿素前体、法尼烯、双桧烯、柠檬烯、蒎烯、异戊烯醇等多种化合物的生产，其中半合成青蒿素已实现产业化。未来需要通过平衡途径表达、缓解中间体毒性和提高产物耐受性来进一步提升产量和实现工业规模生产。