Genetic Modification of Plant Secondary Metabolite Pathways Using Transcriptional Regulators
- 作者
- Johan Memelink, Jan W. Kijne, Robert van der Heijden, Rob Verpoorte
- 单位
- Institute of Molecular Plant Sciences, Clusius Laboratory, Leiden University; Division of Pharmacognosy, Leiden/Amsterdam Center for Drug Research, Leiden University
- DOI
- 10.1007/3-540-45302-4_4
- 所属领域
- 植物次生代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用转录调控因子对植物次生代谢途径进行遗传改造，特别是苯丙烷/类黄酮和萜类吲哚生物碱（TIA）两条典型途径。
研究策略
综述转录因子在植物次生代谢调控中的作用，介绍酵母单杂交和T-DNA激活标签分离调控基因的方法，并展示通过MYB/bHLH和AP2/ERF转录因子进行代谢工程的成功案例。
研究路线图
核心内容
该文系统综述了利用转录因子作为“主开关”对植物次生代谢途径进行遗传改造的策略，重点聚焦苯丙烷/类黄酮和萜类吲哚生物碱两条典型途径。作者介绍了酵母单杂交和T-DNA激活标签两种分离调控基因的方法，并展示了多个跨物种异源表达的成功案例：玉米R和C1转录因子在拟南芥中异源表达可使非着色组织产生色素，Lc在矮牵牛中上调整个类黄酮途径导致叶片深着色。在长春花中，通过T-DNA激活标签筛选约40–50万个转化细胞，从line 46克隆到ORCA3转录因子，其过表达可同时上调色氨酸、色胺合成及多个TIA途径基因，但需添加loganin才能检测到TIA积累。此外，酵母单杂交以JERE为诱饵分离出ORCA1和ORCA2，证实ORCA2特异性结合JERE并反式激活Str表达。这些结果表明转录因子可作为协同调控多基因的有效工具，将代谢流导向目标产物，其跨物种表达具有可行性，为未来结合诱导型启动子和合成转录因子的精准代谢工程奠定了基础。
创新点
提出以转录因子作为‘主开关’（master regulators）实现对植物次生代谢的多基因协同调控；通过T-DNA激活标签从长春花中分离出ORCA3转录因子，证明其可同时调控初级和次生代谢基因；展示了转录因子跨物种异源表达在代谢工程中的潜力。
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 玉米 | 苯丙烷/类黄酮途径 | R | bHLH转录因子 | 调控 | 与C1协同调控花青素生物合成；在拟南芥异源表达诱导非着色组织着色 |
| 玉米 | 苯丙烷/类黄酮途径 | C1 | MYB转录因子 | 调控 | 与R协同调控花青素结构基因 |
| 玉米 | 苯丙烷/类黄酮途径 | Lc | bHLH转录因子 | 调控 | 在矮牵牛中上调整个类黄酮途径，导致叶片深着色 |
| 拟南芥 | 类黄酮生物合成 | TTG1 | WD重复蛋白 | 调控 | 调控MYB/bHLH蛋白活性；其突变体可被玉米R基因恢复 |
| 拟南芥 | 冷调节应答 | CBF1 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 过表达协同上调冷调控基因并增强抗冻性 |
| 拟南芥 | 苯丙烷/类黄酮途径 | HY5 | bZIP转录因子 | 调控 | 结合Chs启动子LRU中的G-box |
| 矮牵牛 | 类黄酮生物合成 | AN11 | WD重复蛋白 | 调控 | 在AN2上游调控MYB活性 |
| 矮牵牛 | 类黄酮生物合成 | AN2 | MYB转录因子 | 调控 | 调控Dfr表达，可互补an11突变体 |
| 金鱼草 | 类黄酮生物合成 | DELILA | bHLH转录因子 | 调控 | 在番茄中增强营养组织着色，在烟草中仅增强花着色 |
| 欧芹 | 苯丙烷/类黄酮途径 | PcMYB1 | MYB转录因子 | 调控 | 结合MRE并反式激活报告基因 |
| 欧芹 | 苯丙烷/类黄酮途径 | CPRF-1 | bZIP转录因子 | 调控 | 响应UV光诱导Chs表达 |
| 菜豆 | 苯丙烷/类黄酮途径 | G/HBF-1 | bZIP转录因子 | 调控 | DNA结合活性受elicitor诱导磷酸化增强 |
| 长春花 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | ORCA3 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 调控Tdc、Str、Sgd、Cpr、D4h及ASα、DXS等初级和次生代谢基因 |
| 长春花 | TIA生物合成 | ORCA2 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 结合JERE并反式激活Str表达 |
| 长春花 | TIA生物合成 | ORCA1 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 不受JA诱导，可能不参与JA响应 |
| 长春花 | TIA生物合成 | CrBPF-1 | MYB-like转录因子 | 调控 | 通过BA区调控Str，JA非依赖途径 |
| 长春花 | TIA生物合成 | Tdc | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺 |
| 长春花 | TIA生物合成 | Str | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化色胺与裂环马钱素缩合 |
| 长春花 | TIA生物合成 | Sgd | 异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶 | 催化 | 催化异胡豆苷脱糖 |
| 长春花 | TIA生物合成 | G10h | 香叶醇10-羟化酶 | 催化 | 细胞色素P450酶，secologanin合成途径 |
| 长春花 | TIA生物合成 | Cpr | NADPH:细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为P450酶提供电子 |
| 长春花 | TIA生物合成 | D4h | 脱乙酰氧基长春花碱4-羟化酶 | 催化 | vindoline生物合成后期步骤 |
| 长春花 | TIA生物合成 | Dat | 乙酰CoA:脱乙酰长春花碱乙酰转移酶 | 催化 | vindoline生物合成最后步骤之一 |
| 长春花 | 色氨酸生物合成 | ASα | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基 | 催化 | ORCA3调控的初级代谢基因 |
| 长春花 | 萜类前体MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | ORCA3调控的初级代谢基因 |
| 番茄 | 防御信号途径 | Pti4/Pti5/Pti6 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 与Pto激酶互作，调控防御基因表达 |
关键发现
- 通过T-DNA激活标签在长春花中筛选了400,000–500,000个独立转化细胞，从诱导的180个4-甲基色氨酸抗性愈伤组织中鉴定出20个Tdc mRNA升高的细胞系，其中6个同时有Str mRNA增高，并从line 46中克隆到ORCA3。（2）ORCA3过表达上调Tdc、Str、Sgd、Cpr、D4h以及初级代谢基因ASα、DXS的表达，使色氨酸和色胺积累显著增加，但未检测到TIA
- 当添加萜类前体loganin后，TIA产量增加。（3）玉米R和C1转录因子在拟南芥中异源表达可使非着色组织产生色素
- Lc在矮牵牛中上调从CHS开始的整个类黄酮途径，导致叶片深着色。（4）酵母单杂交以JERE为诱饵分离出ORCA1和ORCA2，ORCA2特异性结合JERE并反式激活Str表达。（5）CBF1过表达协调上调拟南芥冷调控基因并增强抗冻性。
研究结论
转录因子是改造植物次生代谢的有效工具；ORCA3作为中心调控子可通过调控初级和次生代谢基因将代谢流导向TIA途径；MYB/bHLH和AP2/ERF转录因子跨物种表达具有可行性；未来可结合诱导型启动子和合成转录因子实现更精准的代谢工程。