High-Throughput Testing of Terpenoid Biosynthesis Candidate Genes Using Transient Expression in Nicotiana benthamiana
- 作者
- Søren Spanner Bach, Jean-Étienne Bassard, Johan Andersen-Ranberg, Morten Emil Møldrup, Henrik Toft Simonsen, Björn Hamberger
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2014）
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-0606-2_18
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
随着测序技术的普及，大量推测参与萜类代谢的候选基因（特别是萜类合酶和细胞色素P450）亟待进行功能验证。传统的微生物异源表达系统面临密码子优化、蛋白错误折叠、亚细胞定位改变等难题，而植物稳定转化又耗时且难以进行多基因叠加，缺乏适合高通量筛选的原位表达平台。
研究策略
利用农杆菌介导的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片瞬时表达系统，将候选基因以全长天然序列克隆到T-DNA表达载体，通过农杆菌共浸润实现多基因共表达，结合固相微萃取和GC-MS自动化数据挖掘，实现萜类候选基因的高通量功能鉴定和途径重构。
研究路线图
核心内容
针对测序技术普及后大量萜类候选基因亟待功能验证的瓶颈，本研究建立了一套基于农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬时表达的高通量筛选平台。该方法将候选基因以全长天然序列克隆至T-DNA载体，无需密码子优化或去除转运肽，通过农杆菌共浸润实现多基因“即插即用”共表达，并结合固相微萃取与自动化GC-MS数据挖掘完成代谢产物分析。整个流程从克隆到代谢物检测可在7天内完成，浸润后3-4天即可提取产物，农杆菌悬液OD600为0.4时约5mL可浸润3片叶子并获得3个实验重复。利用该系统成功表达了单萜、倍半萜、二萜和三萜合酶，且无需外源底物，表明内源前体供应充足；通过1:1:1共浸润目的菌株与p19菌株，还成功重构了萜类合酶与细胞色素P450催化的简单萜类途径。该平台有效克服了微生物异源表达中蛋白错误折叠和亚细胞定位改变等问题，也避免了稳定转基因耗时长、难以多基因叠加的局限，为植物萜类候选基因的大规模功能鉴定和多酶途径重构提供了高效解决方案。
创新点
1. 无需密码子优化或去除转运肽，可直接表达全长天然植物萜类基因；2. 利用农杆菌混合共浸润实现多基因"即插即用"共表达，适合途径重构；3. 整个流程从克隆到代谢物分析可在7天内完成，浸润后3-4天即可提取产物；4. 结合自动化GC-MS数据挖掘，适合大规模组合筛选。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 萜类生物合成（terpenoid biosynthesis） | terpene synthase (TPS) | 萜类合酶 | 催化 | 成功表达单萜、倍半萜、二萜和三萜合酶，全长天然序列无需修饰 |
| Nicotiana benthamiana | 萜类生物合成（terpenoid biosynthesis） | cytochrome P450 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 与TPS共表达参与萜类氧化修饰，重构简单生物合成途径 |
| Nicotiana benthamiana | 基因表达调控 | p19 | p19蛋白 | 调控 | 来源于番茄丛矮病毒，抑制转录后基因沉默，提高瞬时表达水平 |
关键发现
- 该平台可在7天内完成候选基因的克隆、转化、浸润和代谢物分析
- 农杆菌浸润后3-4天即可提取代谢物
- 成功表达了单萜、倍半萜、二萜和三萜合酶，且无需外源底物，表明内源前体供应充足
- 通过1:1:1共浸润（两个目的菌株+p19菌株）成功重构了TPS和P450催化的简单萜类途径
- 农杆菌悬液OD600为0.4，约5mL可浸润3片叶子，产生3个实验重复。
研究结论
所建立的本氏烟草瞬时表达平台是一种快速、高通量、适合植物萜类候选基因功能表征的工具，能够克服微生物异源表达和稳定转基因的局限，为多酶萜类途径的发现和重构提供了高效解决方案。