Heterologous Stable Expression of Terpenoid Biosynthetic Genes Using the Moss Physcomitrella patens
- 作者
- Søren Spanner Bach, Brian Christopher King, Xin Zhan, Henrik Toft Simonsen, Björn Hamberger
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2014）
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-0606-2_19
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在植物底盘小立碗藓中实现萜类生物合成基因的稳定异源表达，以克服瞬时表达系统的局限性，并为萜类化合物的功能表征和生物技术生产提供替代方案。
研究策略
利用小立碗藓的高效同源重组能力和简单的内源萜类背景，建立原生质体PEG转化和基因枪转化两种稳定转化方法，结合筛选、培养和代谢物分析流程，实现萜类合成基因的异源表达与产物检测。
核心内容
本研究建立了一套在小立碗藓（Physcomitrella patens）中稳定异源表达萜类生物合成基因的完整技术流程，以克服瞬时表达的局限并实现萜类化合物的功能表征与生物技术生产。利用该苔藓植物高效的同源重组能力和极低的内源萜类背景——其约500 Mb的基因组仅含71个细胞色素P450（拟南芥为246个）且只有一个二萜合酶PpCPS/KS——研究者分别建立了原生质体PEG转化和基因枪转化两种稳定转化方法，并配套筛选、培养及代谢物分析流程。通过优化筛选标记浓度（潮霉素30 μg/mL、G418 50 μg/mL、磺胺嘧啶钠150 μg/mL、庆大霉素100 μg/mL）和原生质体转化密度（1.5–2×10^6个/mL），可在2–3个月内获得转基因系。将来自短叶红豆杉的二萜合酶异源表达后成功积累taxadiene，验证了该平台的实用性。这一方案表明，小立碗藓凭借高同源重组率、低内源化学复杂性及良好的萜类耐受性，是重构异源萜类通路和表征萜类合成酶的理想绿色底盘。
创新点
提供了一套完整的小立碗藓稳定转化和代谢分析方案，利用其独特的基因组编辑优势和低内源化学复杂性，实现萜类生物合成通路的重构与功能验证。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Physcomitrella patens (Gransden ecotype) | 萜类生物合成（二萜） | PpCPS/KS | copalyl-diphosphate synthase/kaurene synthase | 催化 | 内源二萜合酶，负责合成ent-kaurene |
| Physcomitrella patens | 萜类生物合成（二萜） | diterpene synthase from Taxus brevifolia | taxadiene synthase | 催化 | 异源表达产生taxadiene，参考文献[2] |
关键发现
- 小立碗藓基因组约500 Mb，仅含71个细胞色素P450（拟南芥246个、水稻343个），内源仅有一个二萜合酶PpCPS/KS
- 通过稳定转化可在2-3个月内获得转基因系
- 异源表达红豆杉二萜合酶可积累taxadiene
- 筛选标记浓度：潮霉素30 μg/mL、G418 50 μg/mL、磺胺嘧啶钠150 μg/mL、庆大霉素100 μg/mL
- 原生质体转化密度为1.5-2×10^6个/mL。
研究结论
小立碗藓凭借其高同源重组率、低内源萜类背景、对萜类的耐受性以及可放大培养等特性，是异源生产萜类化合物和功能表征萜类合成酶的理想绿色生物技术平台。