Production of Aromatic Plant Terpenoids in Recombinant Baker's Yeast
- 作者
- Anita Emmerstorfer-Augustin, Harald Pichler
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2017）
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-3393-8_8
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在重组酿酒酵母中高效生产植物萜类化合物（如trans-nootkatol），解决疏水底物/产物的相转移问题、挥发性产物损失以及产物对细胞的毒性问题。
研究策略
提供两种优化方案：（1）利用共表达HPO和CPR的静息细胞转化外源(+)-valencene；（2）构建自给自足的生产菌株（共表达ValS、tHMG1、HPO/CPR），并以正十二烷为第二液相在线萃取疏水萜类产物。两种方案均通过延长生长期和温和诱导（降低半乳糖浓度）提高生产率。
研究路线图
核心内容
该研究建立了在重组酿酒酵母中高效生产芳香植物萜类化合物trans-nootkatol的两种优化方案。第一种采用静息细胞生物转化法，将共表达prennaspirodiene oxygenase（HPO）和细胞色素P450还原酶（CPR）的酵母细胞用于转化外源(+)-valencene底物；第二种构建自给自足的生产菌株，共表达(+)-valencene合酶（ValS）、截短型HMG-CoA还原酶（tHMG1）及HPO/CPR，并以正十二烷作为第二液相进行原位产物萃取。两种方案均通过延长诱导前生长期和降低半乳糖诱导浓度（降至原高浓度方案的1/2.5）显著提高生产率，高浓度诱导时萜类生产率仅为优化方案的50%，即降低半乳糖浓度可使生产率提高2倍。过表达tHMG1可增加法尼基焦磷酸（FPP）池从而增强产量。该研究为植物萜类的微生物合成提供了可靠方案，有效解决了疏水产物毒性、相转移及挥发损失等问题。
创新点
延长诱导前的生长期以实现CYP/CPR高效表达；将半乳糖诱导浓度降至原方案高浓度的1/2.5（原高浓度方案仅得到优化方案50%的萜类生产率）；利用正十二烷作为覆盖相进行原位产物捕获和在线萃取，避免产物毒性/反馈抑制。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | HPO | prennaspirodiene oxygenase (HPO) | 催化 | 催化(+)-valencene C2位羟基化生成trans-nootkatol |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | CPR | cytochrome P450 reductase (CPR) from Arabidopsis thaliana | 能量供给 | 为HPO提供NADPH依赖性电子传递 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | ValS | (+)-valencene synthase (ValS) from Callitropsis nooktarensis | 催化 | 将FPP转化为(+)-valencene |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | tHMG1 | 截短型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (tHMG-CoA reductase) | 催化 | 过表达增加乙酰辅酶A到FPP的通量，提高萜类前体供给 |
关键发现
- 使用2.5倍标准浓度的半乳糖诱导时，萜类生产率仅为优化方案的50%，即降低半乳糖浓度可使生产率提高2倍
- 静息细胞转化使用600 OD600单位细胞和100 mM (+)-valencene底物，16 h转化后产物用乙酸乙酯萃取
- 自给自足菌株在正十二烷两相系统中每24 h添加一次诱导液和补充液，共培养48 h
- 过表达tHMG1可增加FPP池，从而增强萜类产量
- 延长生长期是实现CYP/CPR高水平表达的关键因素。
研究结论
建立了两种在重组酿酒酵母中高效生产trans-nootkatol的优化方案：静息细胞生物转化法适用于外源底物转化，自给自足两相发酵法可实现产物在线萃取并避免相转移问题。通过延长生长期和温和诱导可显著提高生产率，为植物萜类的微生物合成提供了可靠方案。