Molecular Tools for Carotenogenesis Analysis in the Mucoral Mucor circinelloides
- 作者
- Francisco E. Nicolás, María Isabel Navarro-Mendoza, Carlos Pérez-Arques, Sergio López-García, Eusebio Navarro, Santiago Torres-Martínez, Victoriano Garre
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2018）
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-8742-9_13
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解决 M. circinelloides 中类胡萝卜素生成研究的分子工具不足问题，提供了一套完整的遗传操作工具，包括转化、基因替换、过表达、RNAi 沉默和功能基因组筛选。
研究策略
详细描述最新的分子技术流程，包括电穿孔转化、基于重叠 PCR 的替换片段构建、通过 carRP 位点整合的稳定过表达、基于 pMAT1702 的 RNAi 功能基因组文库筛选，以及快速 DNA 提取与鉴定方法。
研究路线图
核心内容
该研究系统整合了丝状真菌Mucor circinelloides中类胡萝卜素生成研究所需的分子工具，涵盖电穿孔转化、基因替换、稳定过表达、RNAi沉默及功能基因组筛选等完整流程。在转化方面，使用1–3 μg环状质粒或3–6 μg线性DNA即可高效导入原生质体；基因替换通过重叠PCR构建约1 kb同源臂并借助pyrG标记实现。创新点在于利用carRP位点同源重组实现稳定过表达，转化子在pH 4.5条件下呈现白化斑块，经1–3轮筛选可获得同核体；基于pMAT1702的RNAi平台沉默效率接近95%菌落，功能基因组文库需构建超过73,680个转化子才能以99%概率覆盖基因组。快速硅胶结合法简化了DNA提取流程。该研究为Mucoromycota门基因功能解析提供了系统工具，为类胡萝卜素生物合成调控机制研究及油脂、类胡萝卜素工业生产中的遗传改造奠定了方法学基础。
创新点
更新并补充了稳定的基因过表达技术（通过同源重组整合到 carRP 位点，利用白化菌落快速筛选）和基于 RNAi 的功能基因组筛选平台，适用于类胡萝卜素生物合成调控研究。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mucor circinelloides | 亮氨酸生物合成 | leuA1 | α-异丙基苹果酸合酶 | 催化 | 用作选择标记（亮氨酸营养缺陷型互补） |
| Mucor circinelloides | 嘧啶生物合成 | pyrG | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | 用作选择标记（尿嘧啶营养缺陷型互补），也是基因替换的标记 |
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成 | carRP | 类胡萝卜素合成相关的双功能酶（植物烯合酶/番茄红素环化酶） | 催化 | 作为基因过表达整合靶位点，破坏后产生白化菌落，便于筛选 |
| Mucor circinelloides | 锌离子稳态/转运 | zrt1 | 锌转运蛋白 | 转运 | 其强启动子（Pzrt1）用于驱动基因过表达和 RNAi 发夹结构 |
| Mucor circinelloides | 糖酵解 | gpd1 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 其强启动子（Pgpd1）用于双向 RNAi 沉默载体 |
关键发现
- 电穿孔转化使用 1–3 μg 环状质粒或 3–6 μg 线性 DNA 可高效转化 Mucor 原生质体
- 基因替换需要约 1 kb 同源臂和 pyrG 标记，通过重叠 PCR 构建
- 稳定过表达通过破坏 carRP 位点实现，转化子在 pH
- 5 下产生白化斑块，经 1–3 轮筛选获得同核体
- 发夹 RNA 沉默频率接近 95% 的菌落
- 功能基因组文库需 >73,680 个转化子以保证 99% 概率覆盖基因组（基因组大小
- 6×10^7 bp，插入片段平均
- 25 kb）
- 硅胶结合法快速提取 DNA。
研究结论
M. circinelloides 拥有多种分子工具，成为研究 Mucoromycota 门基因功能的宝贵模型，可用于解析类胡萝卜素生物合成的调控，并为油脂和类胡萝卜素工业生产提供遗传操作基础。