Biosynthetic Approaches to Squalene Production: The Case of Yeast
- 作者
- Martin Valachovič, Ivan Hapala
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-6445-1_7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过遗传改造酵母提高角鲨烯产量，并建立相应的提取、纯化与定量分析方法
研究策略
调控麦角固醇生物合成途径，重点通过ERG1基因点突变降低角鲨烯单加氧酶活性以实现角鲨烯积累，同时结合非皂化脂质提取、SPE纯化、TLC和HPLC分析技术
核心内容
该研究以酿酒酵母为底盘，通过调控麦角固醇生物合成途径提升角鲨烯产量。核心策略是对编码角鲨烯单加氧酶的ERG1基因进行点突变，其中erg1L37P突变体在YPD培养基中培养16–20小时后，40 ml培养物即可产生约1 mg角鲨烯，且不损害细胞生长与活力。研究同时建立了完整的分析流程，包括非皂化脂质提取、CHROMABOND NH2固相萃取柱纯化以及薄层色谱和高效液相色谱定量，其中HPLC-CAD校准方程可准确测定角鲨烯与麦角固醇含量，C8柱上角鲨烯比甾醇晚约6分钟洗脱。此外，亚抑制浓度特比萘芬处理也能有效提高角鲨烯积累水平。结果表明，通过ERG1突变降低角鲨烯单加氧酶活性是提高酵母角鲨烯产量的可行策略，所建立的方法适用于生物技术生产中角鲨烯的提取、纯化与定量分析。
创新点
利用ERG1基因单点突变（如erg1L37P）构建角鲨烯积累菌株，在不影响细胞生长和活力的前提下实现高角鲨烯积累；提供了完整的实验室分析纯化方案，包括SPE和HPLC-CAD定量方法
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇生物合成途径 | ERG1 | Squalene monooxygenase | 催化 | 通过点突变（如erg1L37P）降低酶活性，导致角鲨烯积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | HMG-CoA reductase | 催化 | 过表达截短形式（去除跨膜域）可显著积累角鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇生物合成途径 | ERG9 | Squalene synthase | 催化 | 文中提及作为潜在靶点但未被证明为高效目标 |
| Kluyveromyces lactis | 麦角固醇生物合成途径 | ERG1 | Squalene epoxidase | 催化 | 降低角鲨烯环氧酶活性可提高角鲨烯产量 |
关键发现
- erg1L37P突变体在YPD培养基中培养16-20小时，40 ml培养物可产生约1 mg角鲨烯
- HPLC-CAD定量校准方程：ergosterol[ng]=2E-06*x^2+0.089*x，squalene[ng]=7E-07*x^2+0.1391*x（x为峰面积）
- C8柱上角鲨烯比甾醇晚约6分钟洗脱
- SPE柱（CHROMABOND NH2 500 mg）可负载相当于约500 ml培养物的非皂化脂质
- 亚抑制浓度特比萘芬可有效提高角鲨烯水平
研究结论
通过ERG1基因突变降低角鲨烯单加氧酶活性是提高酵母角鲨烯产量的有效策略，且不损害细胞生长；所描述的实验方法适用于角鲨烯的提取、纯化和定量分析，可用于生物技术生产