Construction of Carotenoid Biosynthetic Pathways Through Chromosomal Integration in Methane-Utilizing Bacterium \*Methylomonas\* sp. Strain 16a
- 作者
- Rick W. Ye, Kristen Kelly
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-879-5_10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在专性甲烷氧化细菌Methylomonas sp. strain 16a中，由于遗传工具不完善且难以引入复杂代谢途径，需要构建遗传稳定、适合工业发酵的类胡萝卜素（角黄素和虾青素）生产菌株。
研究策略
通过染色体整合策略，利用接合转移和同源重组（双交换）将类胡萝卜素合成基因簇整合到基因组非必需位点；采用强启动子（如hps启动子）和增加基因拷贝数（整合第二套虾青素合成基因簇）来优化表达，提高产量。
核心内容
本研究针对专性甲烷氧化细菌Methylomonas sp. strain 16a遗传工具不完善、难以引入复杂代谢途径的问题，采用染色体整合策略构建了遗传稳定的类胡萝卜素生产菌株。通过接合转移和同源重组双交换，将来自不同来源的虾青素合成基因簇（crtWZEidiYIB）整合至基因组非必需位点，并利用强启动子hps驱动表达。结果显示，单拷贝crtZ基因的菌株Ax6-5中虾青素占总类胡萝卜素的64%；进一步整合第二个完整虾青素基因簇的菌株Ax392，虾青素占比提升至95%，其中全反式虾青素占89%。发酵条件下该菌株表现出高度遗传稳定性，且高氧水平对虾青素选择性至关重要。研究表明，通过多拷贝染色体整合可在甲烷氧化细菌中实现稳定、高纯度的虾青素生产，证明了甲烷氧化细菌具备商业化生产类胡萝卜素的工业潜力，为利用甲烷作为碳源合成高附加值产品提供了可行路径。
创新点
首次在专性甲烷氧化细菌中通过多位置染色体整合构建稳定的类胡萝卜素生产菌株；利用不同来源的虾青素合成基因簇（crtWZEidiYIB）避免同源重组不稳定；通过引入第二个完整虾青素基因簇显著提高虾青素比例。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylomonas sp. strain 16a（含衍生株MWM1200、Orihps333、Ax6-5、Ax392） | 甲烷氧化代谢 | — | — | 能量供给 | 以甲烷为唯一碳源和能源，作为类胡萝卜素生产宿主 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 类胡萝卜素生物合成途径 | — | — | 催化 | 从法尼基焦磷酸经crtE、crtY、crtI、crtB合成β-胡萝卜素，再经crtW/crtZ修饰 |
| Methylomonas sp. strain 16a | β-胡萝卜素酮基化 | crtW | β-胡萝卜素酮醇酶 CrtW | 催化 | 催化β-胡萝卜素转化为角黄素，来源为Paracoccus sp. N81106（GenBank D58420）或DC263（GenBank DQ309446） |
| Methylomonas sp. strain 16a | β-胡萝卜素羟基化 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 CrtZ | 催化 | 与CrtW协同催化合成虾青素，来源为Paracoccus sp. N81106或DC263 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 萜类前体合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 CrtE | 催化 | 催化异戊烯基焦磷酸生成香叶基香叶基焦磷酸，来自菌株DC404或DC413 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 类胡萝卜素骨架合成 | crtY | 番茄红素环化酶 CrtY | 催化 | 催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 类胡萝卜素脱氢 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 CrtI | 催化 | 参与八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 类胡萝卜素骨架合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 CrtB | 催化 | 催化香叶基香叶基焦磷酸缩合生成八氢番茄红素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 异戊烯基焦磷酸异构化 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 异构化异戊烯基焦磷酸与二甲基烯丙基焦磷酸，提供C5前体 |
| Methylomonas sp. strain 16a | RuMP甲醛同化途径 | hps | 3-己酮糖-6-磷酸合酶 Hps | 催化 | 其启动子为强启动子，用于驱动类胡萝卜素基因簇表达；编码酶本身催化甲醛固定第一步 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 过氧化物代谢 | ccp | 细胞色素c过氧化物酶 | 催化 | 其基因组位点被选为整合位点，天然启动子驱动第二个虾青素基因簇表达 |
关键发现
- 单拷贝crtZ基因的菌株Ax6-5中，虾青素占总类胡萝卜素的64%
- 整合第二个完整虾青素基因簇的菌株Ax392中，虾青素占总类胡萝卜素的95%，其中全反式虾青素占89%
- 该菌株在发酵条件下表现出高度遗传稳定性，且高氧水平对虾青素选择性至关重要。
研究结论
通过染色体整合多个拷贝的虾青素生物合成基因簇，可以在Methylomonas sp. strain 16a中实现稳定且高纯度的虾青素生产，表明甲烷氧化细菌具有生产商业化类胡萝卜素的工业潜力。