Construction and Utilization of Carotenoid Reporter Systems: Identification of Chromosomal Integration Sites That Support Suitable Expression of Biosynthetic Genes and Pathways
- 作者
- Pamela L. Sharpe, Deana J. DiCosimo
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2012）
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-879-5_13
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
染色体不同整合位点对外源基因表达水平的影响难以预测，需要快速筛选合适的染色体整合位点以优化类胡萝卜素生物合成基因的表达。
研究策略
构建无启动子类胡萝卜素转座子报告系统，利用转座子随机插入宿主染色体后菌落颜色深浅反映插入位点处基因表达强弱，从而筛选最佳整合位点，并通过直接染色体测序确定插入位置。
核心内容
研究建立了一种基于类胡萝卜素可视报告系统的染色体整合位点筛选方法，以解决外源基因在染色体不同位置表达水平差异难以预测的问题。作者构建了无启动子的转座子载体pUTmTn5::392W和pUTmTn5::392，分别携带约6.4 kb和6.9 kb的类胡萝卜素合成基因簇（crtWEidiYIB和crtWZEidiYIB），使其在大肠杆菌染色体中随机插入。由于报告基因缺乏自身启动子，其表达强度完全依赖于插入位点上下游的染色体调控元件，因此菌落颜色深浅可直接反映该位点的内源转录活性。通过目视筛选深色菌落并结合直接染色体测序，即可精确定位支持高表达的基因组区域，无需预设启动子信息。该方法成功实现了角黄素和虾青素合成基因簇的整合位点可视化筛选，为代谢工程中基因和代谢途径的稳定整合提供了简便实用的工具，有助于优化异源生物合成途径在大肠杆菌中的表达水平。
创新点
利用类胡萝卜素（角黄素和虾青素）作为可视化报告分子，通过菌落颜色直观筛选高表达染色体位点；无需预先知道启动子信息，即可定位适合外源基因表达的基因组区域。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成通路 | crtE, crtI, crtY, crtB, idi | — | 催化 | 编码beta-胡萝卜素合成相关酶及异戊烯基焦磷酸异构酶 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成通路 | crtW | — | 催化 | β-胡萝卜素酮化酶，来自Brevundimonas vesicularis DC263 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成通路 | crtZ | — | 催化 | β-胡萝卜素羟化酶，来自Brevundimonas vesicularis DC263 |
| Escherichia coli SY327λpir | — | — | λpir蛋白 | 调控 | 提供R6Kγ复制所需的π蛋白，用于pUTmTn5载体繁殖 |
| Escherichia coli | — | kan | — | 调控 | 卡那霉素抗性基因作为转座子筛选标记 |
| Escherichia coli | — | traJ, traI, oriT | — | 调控 | 供体质粒上的转移功能基因，用于三亲本接合转移 |
关键发现
- 构建了pUTmTn5::392W和pUTmTn5::392两种无启动子转座子载体，分别携带crtWEidiYIB和crtWZEidiYIB基因簇，用于产生角黄素和虾青素。转座子插入后菌落颜色强度与基因表达相关，通过直接染色体测序可确定插入位点。文中提及DNA片段大小：pDCQ392W和pDCQ392类胡萝卜素片段分别约6.4 kb和6.9 kb
- pCR2.1KnR中卡那霉素抗性基因约1.0 kb
- 预期XhoI酶切片段为4.0 kb（载体）和0.94 kb（插入片段）
- 最终质粒酶切预期片段为5.3 kb（载体骨架）、0.8 kb（Kan基因）、6.5 kb（crWEidiYIB基因）和6.9 kb（crWZEidiYIB基因）。
研究结论
该方法通过无启动子类胡萝卜素转座子成功实现了染色体整合位点的可视化筛选，为代谢工程中基因和途径的稳定整合提供了实用工具。