Isolation and Light-Stimulated Expression of Canthaxanthin and Spirilloxanthin Biosynthesis Genes from the Photosynthetic Bacterium Bradyrhizobium sp. Strain ORS278
- 作者
- Eric Giraud, André Verméglio
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2012）
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-879-5_9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
分离并表征光合细菌Bradyrhizobium sp. ORS278中参与角黄素和螺菌黄素合成的crt基因簇，研究其光照调控机制，并通过基因工程提高角黄素产量。
研究策略
利用简并引物PCR和光合基因簇探针筛选基因组文库分离crt基因簇；采用不同波长LED照射评估类胡萝卜素合成的光调控；通过构建crtC/crtD缺失突变体并结合远红光照明将代谢流重新导向角黄素合成。
核心内容
该研究从光合细菌Bradyrhizobium sp. ORS278中分离并表征了两套独立的crt基因簇，分别负责角黄素和螺菌黄素的生物合成。通过简并引物PCR和基因组文库筛选，研究者获得了约45 kb的光合基因簇，发现两条合成途径共享番茄红素作为共同前体。利用不同波长LED照射实验，揭示了细菌光敏色素介导的光调控机制：770 nm远红光可同时上调螺菌黄素基因簇表达，进而刺激两种类胡萝卜素的合成，使角黄素产量增加2倍、螺菌黄素增加3倍。在此基础上，通过构建crtC/crtD基因缺失突变体，将代谢流从螺菌黄素分支重新导向角黄素合成，并结合远红光照明，使工程菌株的角黄素产量达到1.5 mg/g干重，较野生型暗培养条件下的0.3 mg/g干重提高5倍。该研究不仅阐明了光调控类胡萝卜素合成的分子机制，还提供了一种结合基因敲除与光照条件优化的角黄素高产工程策略，为光合细菌中类胡萝卜素的代谢工程改造提供了新思路。
创新点
发现ORS278菌株含有两个独立的crt基因簇分别负责螺菌黄素和角黄素合成；揭示了细菌光敏色素通过远红光上调螺菌黄素基因簇从而同时刺激两种类胡萝卜素合成；开发了通过敲除竞争通路基因并利用光调控提高角黄素产量的工程策略。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bradyrhizobium sp. ORS278 | 角黄素生物合成 | crtE.c, crtI.c, crtB.c, crtY, crtW | CrtE, CrtI, CrtB, CrtY, CrtW | 催化 | 位于canthaxanthin基因簇中，前三个基因与螺菌黄素簇中的同源基因不同 |
| Bradyrhizobium sp. ORS278 | 螺菌黄素生物合成 | crtE.s, crtI.s, crtB.s, crtC, crtD, crtF | CrtE, CrtI, CrtB, CrtC, CrtD, CrtF | 催化 | 螺菌黄素基因簇，其中crtC和crtD被敲除以促进角黄素合成 |
| Bradyrhizobium sp. ORS278 | 光调控 | bacteriophytochrome基因 | Bacteriophytochrome | 调控 | 感知远红光，拮抗PpsR从而上调螺菌黄素基因簇表达 |
| Bradyrhizobium sp. ORS278 | 光合基因表达调控 | ppsR | PpsR | 调控 | 光合基因调控阻遏蛋白，在光照下被光敏色素拮抗 |
关键发现
获得两个crt基因簇（约45 kb光合基因簇）。角黄素和螺菌黄素合成共享番茄红素前体。在770 nm光照下，角黄素产量增加2倍，螺菌黄素产量增加3倍。敲除crtC/crtD后，在770 nm光照下角黄素产量达到1.5 mg/g干重，而野生型暗培养仅0.3 mg/g干重，提高5倍。基因组文库约2000个克隆覆盖7.2 Mb基因组。
研究结论
成功从Bradyrhizobium sp. ORS278中分离了两个crt基因簇，阐明光敏色素介导的光调控机制，并通过基因工程使角黄素产量提高5倍，达到1.5 mg/g干重。