Generation of Astaxanthin Mutants in Xanthophyllomyces dendrorhous Using a Double Recombination Method Based on Hygromycin Resistance
- 作者
- Mauricio Niklitschek, Marcelo Baeza, María Fernández-Lobato, Víctor Cifuentes
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-918-1_15
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在二倍体法夫酵母中，利用单一的选择标记获得靶基因双拷贝纯合突变体。
研究策略
采用双重组方法（DRM）：先通过一次转化获得插入潮霉素B抗性基因的杂合突变体，再通过逐步提高潮霉素B浓度进行亚培养，利用有丝分裂重组使突变体成为纯合子。
研究路线图
核心内容
该研究以二倍体法夫酵母为对象，发展了一种仅依靠潮霉素B抗性作为选择标记的双重组方法（DRM），以实现虾青素合成相关基因的纯合敲除。首先通过一次转化使目标基因单拷贝被潮霉素B抗性表达盒（由TEF-1α启动子和gpd终止子驱动，约1.8 kb）替换，形成杂合突变体；随后在逐步升高的潮霉素B浓度下进行亚培养，利用有丝分裂重组将杂合子转变为纯合子。结果显示，纯合crtYB和crtI突变体呈白化表型，纯合crtS突变体呈黄色菌落，杂合子色素水平低于野生型。抗性水平与基因拷贝数相关，纯合子可在800 μg/mL潮霉素B下生长，而杂合子仅耐受约50 μg/mL。该方法利用剂量依赖的抗性筛选实现二倍体生物的纯合敲除，无需额外标记，为其他二倍体菌株的代谢工程提供了可行策略。
创新点
['仅使用潮霉素B抗性作为唯一选择标记即可实现二倍体酵母的纯合基因敲除', '构建了由法夫酵母TEF-1α启动子和gpd终止子驱动的潮霉素B抗性表达盒']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 虾青素生物合成 | crtYB | CrtYB | 催化 | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶融合蛋白，纯合突变呈白化表型 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 虾青素生物合成 | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，纯合突变呈白化表型 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 虾青素生物合成 | crtS | CrtS | 催化 | 虾青素合酶，纯合突变呈黄色菌落 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 潮霉素B抗性 | hph | 潮霉素B磷酸转移酶 | 催化 | 赋予潮霉素B抗性，作为选择标记 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 基因表达调控 | TEF-1α | — | 调控 | 利用其启动子驱动hph基因表达 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous UCD 67-385 | 基因表达调控 | gpd | — | 调控 | 利用其终止子用于hph表达盒的转录终止 |
关键发现
- 获得crtYB、crtI和crtS基因的杂合与纯合突变体
- 纯合crtYB和crtI突变体呈白化表型，纯合crtS突变体呈黄色菌落
- 纯合子可在800 μg/mL潮霉素B下生长，杂合子仅能在低浓度（如50 μg/mL）下生长
- 杂合子色素水平低于野生型，呈淡色表型
- 构建的潮霉素B抗性表达盒大小约1.8 kb。
研究结论
DRM方法利用有丝分裂重组和剂量依赖的潮霉素B抗性，在二倍体法夫酵母中成功实现多个虾青素合成基因的纯合敲除，该方法可推广到其他二倍体生物。