Molecular Tools for Carotenogenesis Analysis in the Zygomycete Mucor circinelloides
- 作者
- Santiago Torres-Martinez, Rosa M. Ruiz-Vazquez, Victoriano Garre, Sergio López-García, Eusebio Navarro, Ana Vila
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2012）
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-918-1_5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏对产类胡萝卜素接合菌Mucor circinelloides进行分子遗传操作的成套工具，难以深入研究其类胡萝卜素合成与调控机制。
研究策略
系统建立并整合遗传转化（电穿孔）、基因替换（同源重组）、RNA沉默（反向重复发夹RNA）、小RNA分离与检测、免疫沉淀及泛素化分析等分子工具，用于解析类胡萝卜素生物合成调控。
核心内容
本研究以产类胡萝卜素的接合菌Mucor circinelloides R7B为对象，系统建立了一套分子遗传操作工具，包括电穿孔转化、同源重组基因替换、内含子增强的反向重复发夹RNA沉默、小RNA分离检测、免疫沉淀及泛素化分析。电转化采用0.8 kV、25 μF、400 Ω参数，每100 μL原生质体使用1 μg环状DNA或3 μg线性DNA，原生质体酶解约90 min。沉默carB基因获得白化表型，证实该菌siRNA分为21-nt和25-nt两类，沉默载体茎区需大于500-600 bp、环区约300 bp且内含子可增强效率。通过免疫沉淀结合泛素抗体检测，发现MCWC-1b蛋白被CrgA进行单泛素化和双泛素化修饰，野生型中存在106、115、125 kDa三种泛素化形式，揭示蛋白酶非依赖的泛素化调控机制。基因替换需经2-4轮孢子循环获得纯合转化子。这些工具使该菌成为研究类胡萝卜素代谢调控的模式生物，为工业菌株分子改良奠定了基础。
创新点
利用含内含子的反向重复序列构建沉默载体，提高RNA沉默效率；通过免疫沉淀结合泛素抗体检测MCWC-1b蛋白的泛素化修饰，揭示蛋白酶非依赖的泛素化调控机制。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mucor circinelloides R7B | β-胡萝卜素生物合成 | carB | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 沉默该基因导致白化转化子，NCBI accession AJ238028 |
| Mucor circinelloides R7B | 类胡萝卜素生物合成调控 | crgA | CrgA（RING-finger泛素连接酶） | 调控 | 黑暗中抑制类胡萝卜素合成，通过泛素化修饰MCWC-1b |
| Mucor circinelloides R7B | 光诱导类胡萝卜素合成 | mcvc-1c | MCWC-1c（White Collar-1样蛋白） | 调控 | 光诱导类胡萝卜素合成所需 |
| Mucor circinelloides R7B | 类胡萝卜素合成调控 | mcvc-1b | MCWC-1b（White Collar-1样激活子） | 调控 | 作为类胡萝卜素合成激活子，被CrgA进行泛素化修饰 |
| Mucor circinelloides R7B | 氨基酸生物合成 | leuA1 | — | 催化 | 亮氨酸营养缺陷互补的选择标记基因 |
| Mucor circinelloides R7B | 嘧啶生物合成 | pyrG | — | 催化 | 尿嘧啶营养缺陷选择标记基因 |
| Mucor circinelloides R7B | — | gpd1启动子 | — | 调控 | 强启动子，驱动沉默载体中发夹RNA转录 |
关键发现
- 电转化条件为0.8 kV、25 μF、400 Ω，每100 μL原生质体使用1 μg环状DNA或3 μg线性DNA
- 原生质体制备需要约90 min酶解。Mucor circinelloides中siRNA有21-nt和25-nt两类，沉默载体茎区需大于500-600 bp，环区约300 bp，内含子可增强沉默效率
- 沉默carB基因（phytoene dehydrogenase）导致白化表型。MCWC-1b蛋白被CrgA进行单泛素化和双泛素化修饰，在野生型中检测到106、115、125 kDa泛素化形式。免疫沉淀使用1-5 μg抗体，Western blot一抗稀释度为1:2500
- 基因替换需经过2-4轮孢子循环获得纯合转化子。
研究结论
这些分子工具使Mucor circinelloides成为研究类胡萝卜素代谢和调控的模式生物，并为工业上通过分子手段改良产类胡萝卜素菌株提供了基础。