Metabolic Engineering of Mucor circinelloides for Zeaxanthin Production
- 作者
- Marta Rodríguez-Sáiz, Juan-Luis de la Fuente, José-Luis Barredo
- 杂志
- Methods in Molecular Biology（2012）
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-918-1_8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何通过代谢工程手段在产β-胡萝卜素的丝状真菌Mucor circinelloides中实现玉米黄质（zeaxanthin）等叶黄素的异源生产，以及克服crtS基因因含多个内含子而难以在异源宿主中正确表达的问题。
研究策略
从产虾青素的Xanthophyllomyces dendrorhous中提取RNA，通过RT-PCR克隆crtS基因的cDNA（已剪接内含子），将其置于Blakeslea trispora的carRA启动子控制下构建自主复制质粒pALMC11，通过PEG介导的原生质体转化导入M. circinelloides MS12，经亮氨酸营养缺陷互补筛选转化子，并用HPLC分析类胡萝卜素组成。
核心内容
该研究通过代谢工程手段在丝状真菌Mucor circinelloides中实现了玉米黄质的异源生产。研究者从产虾青素的Xanthophyllomyces dendrorhous中提取RNA，利用RT-PCR克隆获得长度为1674 bp的crtS基因cDNA，成功克服了该基因因含17个内含子而难以在异源宿主中正确剪接表达的难题。将crtS cDNA置于来自Blakeslea trispora的carRA强启动子控制下，构建自主复制质粒pALMC11，通过PEG介导的原生质体转化导入M. circinelloides MS12菌株，经亮氨酸营养缺陷互补筛选获得转化株。HPLC分析结果显示，转化株如MS12/T6在474 nm检测波长下积累β-隐黄质和玉米黄质，而亲本菌株仅积累β-胡萝卜素，菌落呈现更深的黄色。该结果表明crtS基因编码的酶具有β-胡萝卜素羟化酶活性，能够将β-胡萝卜素逐步转化为玉米黄质，为利用M. circinelloides作为底盘细胞生产高价值叶黄素提供了可行策略。
创新点
（1）利用cDNA而非基因组DNA克服了crtS基因17个内含子在异源宿主中剪接困难的问题；（2）首次在M. circinelloides中异源表达crtS基因，获得β-隐黄质和玉米黄质积累的转化株；（3）采用来源于B. trispora的强启动子carRA驱动表达；（4）建立了从X. dendrorhous发酵、RNA纯化、RT-PCR到M. circinelloides转化及HPLC检测的完整操作流程。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous Y2476 | 类胡萝卜素生物合成 | crtS | CrtS | 催化 | 来源菌株，crtS编码β-胡萝卜素羟化酶/酮化酶，含17个内含子，通过RT-PCR克隆其cDNA |
| Mucor circinelloides MS12 | 类胡萝卜素生物合成 | crtS (cDNA) | CrtS | 催化 | 异源表达crtS cDNA后，将β-胡萝卜素羟化为β-隐黄质和玉米黄质 |
| Mucor circinelloides MS12 | 类胡萝卜素生物合成 | carRA启动子 (来自Blakeslea trispora) | — | 调控 | 用于驱动crtS cDNA表达的强启动子，位于质粒pALMC11中 |
关键发现
实验成功克隆了大小为1674 bp的crtS cDNA（对应1.6 kb的编码区），构建的pALMC11质粒含611 bp的carRA启动子。将该质粒转化M. circinelloides MS12后获得的转化株（如MS12/T6）在YNB培养基上呈现比亲本更深的黄色色素，HPLC分析（474 nm检测）显示其积累β-隐黄质和玉米黄质，而亲本菌株仅积累β-胡萝卜素。这表明crtS基因编码的酶具有β-胡萝卜素羟化酶活性，能将β-胡萝卜素转化为β-隐黄质和玉米黄质。但文中未报告具体产量数值。
研究结论
本研究证明crtS基因参与了β-胡萝卜素向叶黄素（包括玉米黄质）的转化，异源表达该基因是工程化改造类胡萝卜素代谢途径、实现玉米黄质微生物生产的有效策略，也为利用M. circinelloides作为底盘细胞生产高价值叶黄素奠定了基础。