Construction and Engineering of Large Biochemical Pathways via DNA Assembler

作者: Zengyi Shao, Huimin Zhao
DOI: 10.1007/978-1-62703-625-2_9
所属领域: 合成生物学/代谢工程
关键词: DNA组装代谢工程体内同源重组合成生物学基因簇表征与工程途径工程
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解决的核心问题

传统多步骤克隆方法耗时费力且依赖限制性酶切位点，难以快速构建和工程化大型生化途径；同时天然产物生物合成基因簇的表征与改造困难。

研究策略

利用酿酒酵母高效的体内同源重组机制，开发DNA assembler方法，将多个表达盒或基因簇片段（含助载体片段）通过共转化一步组装成完整质粒，并通过PCR引入位点突变等精细遗传操作。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究开发了一种基于酿酒酵母体内同源重组机制的DNA assembler方法，用于一步构建和工程化大型生化途径。该方法将多个基因表达盒或天然产物基因簇片段连同载体骨架共转化酵母细胞，依靠高效的体内重组实现完整质粒的自组装，无需传统限制性酶切和体外连接步骤，并通过PCR引入点突变等精细操作对途径进行改造。研究者以玉米黄素生物合成途径（crtE/crtB/crtI/crtY/crtZ）和Aureothin基因簇为模型进行验证，结果显示平均组装效率达60%–80%；组装约25 kb的大片段时，采用125 bp同源臂可将效率提升至50%以上，而50 bp同源臂仅为10%–20%。此外，通过对AurB脱水酶结构域引入H964A及H964A/D1131A双突变，产物分子量均为414.4，并表现出+16的质谱偏移，证明该方法可有效支持基因簇的定点改造。这一策略为大型生化途径的快速构建、天然产物基因簇的功能表征及代谢工程优化提供了通用且高效的技术工具。

创新点

['一步组装多个基因或基因簇，无需传统限制性酶切连接', '可组装大片段（约25 kb）且效率高', '便于天然产物基因簇的快速表征与工程化，包括点突变和基因缺失', '通用性强，适合合成生物学和代谢工程']

研究对象（6）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Saccharomyces cerevisiae	zeaxanthin biosynthetic pathway	crtE	—	催化	来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因
Saccharomyces cerevisiae	zeaxanthin biosynthetic pathway	crtB	—	催化	来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因
Saccharomyces cerevisiae	zeaxanthin biosynthetic pathway	crtI	—	催化	来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因
Saccharomyces cerevisiae	zeaxanthin biosynthetic pathway	crtY	—	催化	来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因
Saccharomyces cerevisiae	zeaxanthin biosynthetic pathway	crtZ	—	催化	来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因
Streptomyces lividans	aureothin biosynthetic gene cluster	aurB	AurB（聚酮合酶，含脱水酶结构域）	催化	来源于Streptomyces thioluteus；在酵母中组装后异源表达于S. lividans；构建H964A与H964A/D1131A突变体

关键发现

以玉米黄素生物合成途径（crtE/crtB/crtI/crtY/crtZ）和Aureothin基因簇为例，DNA assembler平均组装效率为60%-80%
组装约25 kb通路时，125 bp同源臂可提高效率至>50%，而50 bp同源臂效率仅为10%-20%
玉米黄素标准品在HPLC中于19.9 min洗脱
aureothin及其衍生物在LC-MS中分别于17.8 min和15.8 min出峰
AurB DH H964A突变及H964A/D1131A双突变产物的分子量为414.4，表现出+16质谱偏移模式。

研究结论

DNA assembler是一种快速、高效、灵活且通用的方法，能够一步构建和工程化大型生化途径，在途径工程、代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用前景。