Progress in cellular engineering of plants: biochemical and genetic assessment of selectable markers from cultured cells
- 作者
- Ioan Negrutiu, Michel Jacobs, Arlette Cattoir-Reynaerts
- 单位
- Plantegenetica, Instituut voor Moleculaire Biologie, Vrije Universiteit Brussel, B-1640 Sint-Genesius Rode, Belgium
- DOI
- 10.1007/BF00017783
- 所属领域
- 植物细胞工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏稳定且充分鉴定的选择标记以及高效的异源基因导入技术，限制了高等植物基因工程与细胞工程的发展。
研究策略
系统综述多种生化突变体（如氨基酸类似物抗性、硝酸还原酶缺陷等）的选择标记特性，并探讨γ融合和卵细胞转化等非媒介途径在异源基因导入中的应用与比较。
研究路线图
核心内容
该研究系统评估了多种可用于植物细胞工程的选择标记，涵盖氨基酸类似物抗性、硝酸还原酶缺陷、乙醇脱氢酶零突变及营养缺陷型等类型。在生化与遗传特性鉴定中，AEC抗性突变体赖氨酸超产10至20倍，抗性提高25至50倍，突变频率为2×10⁻⁷；NR缺陷突变体自发频率10⁻⁶、诱发频率10⁻⁵，回复突变率10⁻⁷至10⁻⁶。DNA介导基因转移可使NR活性恢复至对照的35%至88%，校正频率较自发回复高约10倍。γ融合校正频率介于4×10⁻⁴至2×10⁻⁵之间。用380,000个T1种子筛选未获完全抗性个体，仅出现310个弱抗性个体且分离比不符合3:1，提示外源基因整合与表达尚不稳定。胡萝卜突变体积累苏氨酸8倍、异亮氨酸3倍。该工作证实多种选择标记已具备实用性，卵细胞转化和γ融合虽为可行途径，但缺乏基因转移的直接分子证据，需进一步改进与验证，为植物基因工程中标记选择与转化策略提供了系统性参考。
创新点
系统评估了多种选择标记的遗传学和生化特征；提出并比较了卵细胞转化和γ融合两种新途径，强调选择标记与植物再生能力结合的重要性。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana sylvestris | 天冬氨酸家族氨基酸合成 | — | 天冬氨酸激酶(AK) | 催化 | 赖氨酸+苏氨酸抗性突变体，AK反馈敏感性未改变，突变频率约10^-7 |
| Nicotiana sylvestris | 赖氨酸生物合成 | — | 二氢二吡啶甲酸合成酶(DHPS) | 催化 | AEC抗性突变体，赖氨酸超产10-20倍，AEC抗性25-50倍，突变频率2×10^-7，单显性核基因遗传 |
| Daucus carota | 天冬氨酸家族氨基酸合成 | — | 天冬氨酸激酶(AK) | 催化 | 赖氨酸+苏氨酸抗性突变体，AK对赖氨酸敏感性部分丢失，苏氨酸积累8倍，异亮氨酸积累3倍 |
| Hordeum sativum | 天冬氨酸家族氨基酸合成 | — | 天冬氨酸激酶(AK) | 催化 | RLT8突变体，AK对赖氨酸敏感性降低，半显性单基因遗传，由60000个胚筛选获得3个突变体 |
| Arabidopsis thaliana | 赖氨酸生物合成 | — | 二氢二吡啶甲酸合成酶(DHPS) | 催化 | AEC抗性突变体，赖氨酸或苏氨酸超产，从M2种子筛选获得48个突变体 |
| Nicotiana plumbaginifolia | 硝酸盐同化 | nia/cnx | 硝酸还原酶(NR) | 催化 | 氯酸盐抗性突变体，NR活性缺失或泄漏，自发频率10^-6，诱发频率10^-5，回复突变率10^-7~10^-6，单隐性基因遗传 |
| Arabidopsis thaliana | 酒精发酵 | ADH-1 | 乙醇脱氢酶(ADH) | 催化 | 烯丙醇抗性突变体，ADH零活性，突变频率3.7×10^-5，用于转化筛选 |
| Nicotiana plumbaginifolia | 氨基酸生物合成 | — | 苏氨酸脱氨酶等多种合成酶 | 催化 | 多种氨基酸营养缺陷型（ile-, his-, met-, leu-等），通过BUDR负筛选获得13个突变体，涉及相应酶的缺陷 |
| Nicotiana sylvestris | 冠瘿碱合成 | — | 章鱼碱合成酶/胭脂碱合成酶 | 催化 | Ti质粒转化获得的冠瘿碱合成标记，孟德尔遗传，T-DNA整合稳定 |
| Zea mays | 酒精发酵 | Adh1 | 乙醇脱氢酶(ADH) | 催化 | ADH基因已克隆，可作为显性选择标记用于载体设计 |
| Nicotiana sylvestris | 硝酸盐同化 | — | 硝酸还原酶(NR) | 催化 | NR缺陷突变体用于DNA介导基因转移，外源DNA校正频率为10^-6~10^-5，比自发回复高约10倍 |
| Datura innoxia | 色氨酸生物合成 | — | 邻氨基苯甲酸合成酶(AS) | 催化 | 5-甲基色氨酸抗性突变体，AS反馈抑制改变 |
关键发现
- AEC抗性突变体赖氨酸超产10-20倍，AEC抗性提高25-50倍，突变频率2×10^-7
- NR缺陷突变体自发频率10^-6，诱发频率10^-5，回复突变率10^-7~10^-6
- DNA介导基因转移校正频率比自发回复高约10倍（10^-6~10^-5），NR活性恢复植株活性为对照的35%-88%
- 组氨酸营养缺陷型回复频率自发2×10^-7、诱发4.8×10^-6
- ADH零突变频率3.7×10^-5
- γ融合校正频率4×10^-4~2×10^-5
- 用380,000个T1种子筛选未获完全抗性个体，出现310个弱抗性个体且分离比不符合3:1
- 胡萝卜突变体积累苏氨酸8倍、异亮氨酸3倍。
研究结论
已获得多种稳定的选择标记，可用于植物细胞工程中的异源基因转移与遗传操作；卵细胞转化和γ融合是可行的途径，但目前尚缺乏基因转移的直接分子证据，需进一步改进和验证。