Cloning of an Arabidopsis thaliana cDNA coding for farnesyl diphosphate synthase by functional complementation in yeast
- 作者
- Didier Delourme, François Lacroute, Francis Karst
- 单位
- Laboratoire de Génétique Physiologique et Moléculaire, Institut de Biologie Moléculaire et d'Ingénierie Génétique, Université de Poitiers, 86022 Poitiers Cedex, France; Centre de Génétique Moléculaire, CNRS, 91198 Gif sur Yvette, France
- 杂志
- Plant Molecular Biology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00019499
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从拟南芥中克隆编码法尼基二磷酸合酶的cDNA，并验证其功能，以理解植物类异戊二烯生物合成及底物区室化。
研究策略
利用酵母FPP合酶缺陷突变株（erg20-2和erg20缺失）通过功能互补筛选拟南芥cDNA文库。
研究路线图
核心内容
本研究通过功能互补策略，从拟南芥中克隆了编码法尼基二磷酸合酶（FPP合酶）的cDNA。利用酵母FPP合酶缺陷突变株（erg20-2及erg20缺失），筛选拟南芥cDNA文库，获得全长约1.22 kb的插入片段（1314 bp），编码343个氨基酸，推算分子量约39689 Da。该cDNA能够互补酵母erg20缺失的致死表型，证明其编码具有功能的FPP合酶。序列比对显示，该酶与酵母、大鼠和人FPP合酶的氨基酸同一性分别为51%、47%和46%。体外酶活测定表明，重组酶催化产物含25%的牻牛儿基焦磷酸（GPP）和75%的法尼基焦磷酸（FPP）。在表达植物FPP合酶的酵母菌株DD163中，FPP合酶比活性较野生型低10倍以上，但5,7-二烯醇含量仅降低约10%，暗示植物酶在体内可能受到不同调控。Southern blot分析提示拟南芥基因组可能仅含单个FPP合酶基因，同时存在一个或多个亲缘较远的基因。该研究揭示了拟南芥FPP合酶的分子特性，为理解植物类异戊二烯生物合成的底物区室化提供了基础。
创新点
无需核酸序列同源性，通过功能互补策略成功克隆拟南芥FPP合酶cDNA；该cDNA能互补酵母erg20缺失的致死表型；Southern分析提示拟南芥可能仅含单个FPP合酶基因。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae | 萜类/甾醇生物合成 | erg20-2（突变型ERG20） | 法尼基二磷酸合酶（突变体） | 催化 | 宿主菌株CC25携带该突变，导致FPP合酶缺陷，用于功能互补筛选。 |
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae | 法尼基二磷酸生物合成 | AtFPS（拟南芥cDNA） | 拟南芥法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 在菌株DD163中互补酵母ERG20基因缺失，恢复野生型表型。 |
| 拟南芥 Arabidopsis thaliana (ecotype Landsberg erecta) | 异戊二烯代谢 | FPS基因 | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | cDNA从拟南芥cDNA文库中克隆，Southern分析显示可能为单拷贝基因。 |
关键发现
- cDNA全长约1.22 kb（插入片段1314 bp），编码343个氨基酸，推算分子量39689 Da
- 与酵母、大鼠和人FPP合酶的氨基酸序列同一性分别为51%、47%和46%。在表达植物FPP合酶的酵母菌株DD163中，FPP合酶比活性比野生型低10倍以上，但5,7-二烯醇含量仅降低约10%。体外酶活产物含25% GPP和75% FPP。Southern blot表明拟南芥基因组可能含单个FPP合酶基因及一个或多个亲缘较远的基因。
研究结论
成功克隆了拟南芥FPP合酶cDNA，编码的酶能催化从IPP到FPP的两步缩合反应，推测为胞质蛋白；拟南芥可能只有一个FPP合酶基因，同时存在其他亲缘较远的前烯基转移酶基因。