Jasmonate-inducible expression of a potato cathepsin D inhibitor-GUS gene fusion in tobacco cells
- 作者
- Atsushi Ishikawa, Teruhiko Yoshihara, Kenzo Nakamura
- 单位
- Laboratory of Biochemistry, School of Agriculture, Nagoya University; Department of Bioscience and Chemistry, Faculty of Agriculture, Hokkaido University; Faculty of Biotechnology, Fuhui Prefectural University
- 杂志
- Plant Molecular Biology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00039549
- 所属领域
- 植物分子生物学
- 关键词
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解决的核心问题
研究马铃薯组织蛋白酶D抑制剂(CDI)基因启动子在烟草悬浮细胞中对茉莉酸甲酯(MJA)的响应性，并解析其顺式作用元件及调控机制。
研究策略
构建CDI启动子与GUS报告基因的融合基因（CDI:GUS），转化烟草BY-2悬浮细胞，通过启动子系列缺失和寡核苷酸插入突变分析MJA响应区域，并检测不同茉莉酸类化合物及生长素对表达的影响。
研究路线图
核心内容
该研究构建了马铃薯组织蛋白酶D抑制剂（CDI）基因启动子与GUS报告基因的融合载体，转化烟草BY-2悬浮细胞，系统解析了茉莉酸甲酯（MJA）诱导表达的调控机制。通过启动子系列缺失和寡核苷酸插入突变，将MJA响应必需区域定位至-100至-82区间，但该区域单独不足以赋予响应性，提示至少需两个顺式元件协同作用。研究证实该诱导对茉莉酸（JA）和MJA高度特异，其他相关化合物几乎无活性，且生长素抑制此表达，与细胞分裂状态相关。关键数据方面，50 μM MJA处理后GUS比活在约12小时滞后开始升高；用aphidicolin阻断细胞分裂后，MJA诱导的GUS比活可达约40000 pmol/min/mg蛋白。缺失至-100的启动子仍响应MJA但表达水平较2.4kb完整启动子显著降低，而缺失至-81或-65及-100插入突变体完全丧失响应性。该工作揭示了CDI启动子介导茉莉酸信号转导的多元件协同机制，为植物防御基因转录调控研究提供了重要模型。
创新点
发现烟草细胞中CDI:GUS融合基因的MJA诱导表达对茉莉酸(JA)和MJA高度特异，其他相关化合物无诱导活性；揭示生长素抑制该表达且与细胞分裂状态相关；将MJA响应必需区域定位到CDI启动子-100至-82之间，并证明该区域单独不足以赋予MJA响应性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草BY-2细胞（Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow） | — | — | — | 区室化 | 悬浮培养细胞，用于转化和MJA诱导表达分析 |
| — | 茉莉酸信号通路 | — | — | 调控 | MJA/JA为信号分子，调控CDI启动子表达 |
| — | 茉莉酸信号通路 | CDI (gCDI-A1) | — | 调控 | 马铃薯CDI基因的2.4kb启动子，驱动GUS报告基因，受MJA诱导 |
| — | — | uidA (GUS) | β-葡萄糖醛酸苷酶 (GUS) | 催化 | 报告基因，其编码酶催化荧光底物水解 |
| — | — | CaMV 35S:intron-GUS | — | 催化 | 对照构建体，组成型表达GUS，不受MJA诱导 |
| — | — | CDI启动子突变体（-100、-81、-65、-100I） | — | 调控 | 用于定位MJA响应顺式元件，-100至-82必需但不足够 |
| — | — | — | CDI蛋白（cathepsin D inhibitor） | 调控 | Kunitz型蛋白酶抑制剂，在块茎和花芽组成型表达，叶片中受MJA诱导 |
关键发现
- 50 μM MJA处理后，GUS比活在约12小时滞后开始升高
- 在含2,4-D培养基中，5 μM以上MJA可诱导表达，至500 μM仍未饱和
- 用aphidicolin阻断细胞分裂后，MJA诱导的GUS比活可达约40000 pmol/min/mg蛋白
- JA和MJA活性最高，CA、TA、HJA等几乎无诱导活性
- MHJA可特异增强MJA诱导表达
- 缺失至-100的启动子仍响应MJA，但表达水平较2.4kb启动子显著降低
- 缺失至-81或-65以及-100插入突变体丧失MJA响应性。
研究结论
马铃薯CDI基因启动子在烟草BY-2细胞中介导MJA诱导表达，该表达受生长素抑制且与细胞分裂状态相关；MJA响应需要至少两个顺式元件协同作用，-100至-82区域是必需的但不充分。