Identification and genetic analysis of normal and mutant phytoene synthase genes of tomato by sequencing, complementation and co-suppression
- 作者
- Rupert G. Fray, Donald Grierson
- 单位
- AFRC Research Group in Plant Gene Regulation, Department of Physiology and Environmental Science, University of Nottingham, Faculty of Agricultural and Food Science, Sutton Bonington, Loughborough, LE12 5RD, UK
- 杂志
- Plant Molecular Biology（1993）
- DOI
- 10.1007/BF00047400
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定番茄果实成熟过程中八氢番茄红素合成酶基因 Psy1，解析两个黄色果实突变体（r 和 r^v）缺乏类胡萝卜素的分子机制。
研究策略
通过 DNA 测序、PCR 和 Southern 杂交分析突变体 Psy1 基因结构，并采用含 TOM5 cDNA 的 CaMV 35S 启动子过表达构建体转化突变体进行功能互补实验。
核心内容
该研究通过测序、功能互补及共抑制实验，鉴定了番茄果实成熟过程中八氢番茄红素合成酶基因Psy1（TOM5），并解析了两个黄色果实突变体r和rᵛ缺乏类胡萝卜素的分子机制。结果显示，r突变体的TOM5 mRNA约850 nt，比野生型短约750 nt，其cDNA前319 nt与野生型一致，随后328 bp为新序列并含高度重复元件，预测产生17.9 kDa截短蛋白；rᵛ突变体cDNA缺失最后237 bp同源序列并替换为185 bp新序列，导致C端25个氨基酸被23个无关氨基酸取代，证实两者均为Psy1基因异常重排所致。利用CaMV 35S启动子过表达TOM5 cDNA可恢复突变体番茄红素合成，过表达株pBDH5ST14成熟果实总类胡萝卜素达81 μg/g（番茄红素43 μg/g），与野生型相当；而共抑制株pBDH5ST10叶片类胡萝卜素降至130 μg/g，成熟果实仅1.6 μg/g，并发生光漂白。此外，反义抑制实验可将果实类胡萝卜素降至正常的3%–5%。该研究还提示番茄绿色组织和花中存在其他八氢番茄红素合成酶基因。这些结果明确了Psy1突变是r和rᵛ表型的遗传基础，同时表明TOM5正义构建体在不同转化株中可引发过表达或共抑制两种相反效应，为利用Psy1修饰果实色素及研究共抑制机制提供了材料。
创新点
证明 r 和 r^v 突变由 Psy1 基因中的异常重排导致；利用过表达恢复番茄红素合成；发现同一 TOM5 正义构建体在不同转化株中可引发过表达或共抑制两种相反效应，并导致光漂白。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig） | 类胡萝卜素生物合成途径 | Psy1 (GTOM5/TOM5) | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 果实成熟时特异表达，催化两分子 GGPP 缩合生成八氢番茄红素；r 和 r^v 等位基因位于第 3 号染色体。 |
| 番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig） | 类胡萝卜素生物合成途径 | r 突变体 Psy1 等位基因 | 截短的无活性八氢番茄红素合成酶（预测 17.9 kDa） | 催化 | 异常转录本含 328 bp 重复序列插入，功能丧失，导致果实无类胡萝卜素。 |
| 番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig） | 类胡萝卜素生物合成途径 | r^v 突变体 Psy1 等位基因 | C 端变异的八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 缺失最后 237 bp 同源序列，C 端 25 个氨基酸被 23 个无关氨基酸替换，失去活性。 |
| 番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig） | 类胡萝卜素生物合成途径 | Psy2 (clone F) | 八氢番茄红素合成酶同源蛋白 | 催化 | 与 Psy1 同源性有限，推测可能为假基因；但实验提示绿色组织和花中还有其他 Psy 相关基因表达。 |
| 番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig） | 类胡萝卜素生物合成途径 | TOM5 cDNA（Psy1 编码序列） | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 构建于 CaMV 35S 启动子表达载体 pBDH5ST，转化突变体后可恢复番茄红素合成或引发共抑制。 |
关键发现
- r 突变体的 TOM5 mRNA 约 850 nt，比野生型短约 750 nt；r^v 突变体 mRNA 约短 50 nt。r 突变体 cDNA 前 319 nt 与野生型相同，随后 328 bp 为新序列（含高度重复元件），预测产生
- 9 kDa 截短蛋白；r^v cDNA 缺失最后 237 bp 同源序列，替换为 185 bp 新序列，导致 C 端 25 个氨基酸被 23 个无关氨基酸替换。反义抑制实验曾使果实类胡萝卜素降至正常的 3%-5%。过表达株 pBDH5ST14 成熟果实总类胡萝卜素 81 μg/g，其中番茄红素 43 μg/g（野生型为 65 μg/g 和 42 μg/g）；pBDH5ST21 未熟果中番茄红素 15 μg/g；共抑制株 pBDH5ST10 叶片类胡萝卜素降至 130 μg/g、叶绿素 556 μg/g，未熟果类胡萝卜素 4 μg/g，成熟果仅
- 6 μg/g，且叶、果发生光漂白。
研究结论
r 和 r^v 是 Psy1 基因的突变等位基因；番茄绿色组织和花中存在其他的八氢番茄红素合成酶基因。TOM5/Psy1 可作报告基因并用于修饰花和果实色素，同时为共抑制现象的研究提供了材料。