高级醇 · 代谢工程文献库

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Amplification of three threonine biosynthesis genes in Corynebacterium glutamicum and its influence on carbon flux in different strains

作者
Bernhard J. Eikmanns, Markus Metzger, Dieter Reinscheid, Manfred Kircher, Hermann Sahm
单位
Institut für Biotechnologie 1 des Forschungszentrums Jülich GmbH, Postfach 19 13, D-5170 Jülich, Federal Republic of Germany; Degussa AG, Kantstrasse 2, D-4802 Halle-Künsebeck, Federal Republic of Germany
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（1991）
DOI
10.1007/BF00167910
所属领域
代谢工程
关键词
Corynebacterium glutamicumcarbon fluxgene amplificationhom-thrB operonhomoserine dehydrogenasehomoserine kinasethreonine biosynthesisthreonine synthase
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解决的核心问题

研究在谷氨酸棒杆菌中扩增苏氨酸生物合成基因对碳流分配的影响，明确苏氨酸合成途径中的限速步骤，并构建基因工程苏氨酸生产菌株。

研究策略

将野生型的hom-thrB操纵子、抗反馈抑制的homFBR、thrC基因单独或组合克隆到大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEK0中，导入野生型、赖氨酸生产菌株DG 52-5和赖氨酸+苏氨酸生产菌株DM 368-3，通过测定酶活性和发酵产物（苏氨酸、赖氨酸、高丝氨酸等）分析碳流变化。

研究路线图

100%
研究问题：苏氨酸合成基因扩增对碳流分配的影响
策略：构建pEK0载体克隆不同基因组合
关键改造：三类菌株导入重组质粒
野生型13032：高酶活但无氨基酸分泌
DG 52-5：hom-thrB使碳流转向苏氨酸
DM 368-3：homFBR-thrB高效产苏氨酸14.1
结果：TS过表达无额外影响，生长减缓
结论：需抗反馈抑制的天冬氨酸激酶+HDH+HK
建议：引入lysC-FBR与homFBR-thrB组合
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核心内容

该研究在谷氨酸棒杆菌中系统扩增苏氨酸生物合成途径基因，以解析碳流分配机制并构建高产菌株。作者将野生型hom-thrB操纵子、抗反馈抑制的homFBR及thrC基因单独或组合克隆至穿梭载体pEK0，导入野生型、赖氨酸生产菌DG 52-5及赖氨酸/苏氨酸生产菌DM 368-3中，通过酶活测定和发酵产物分析评估碳流变化。结果显示，重组菌株中高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶比活力分别提高8-12倍、15-25倍和8-12倍。关键发现是，在分泌22.7 mM赖氨酸的DG 52-5中过表达hom-thrB后，赖氨酸降至7.0 mM并产生14.0 mM苏氨酸；而过表达homFBR-thrB使DM 368-3产生14.1 mM苏氨酸且无高丝氨酸积累。单独过表达thrC对产物生成无影响，证明苏氨酸合酶并非限速步骤。研究还发现，过表达抗反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶使DM 368-3积累12.3 mM高丝氨酸而赖氨酸几乎为零，说明天冬氨酸激酶是碳流进入该途径的关键限速点。该工作明确了同时扩增抗反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶是高效生产苏氨酸的必要条件，并建议进一步组合抗反馈抑制的天冬氨酸激酶以突破途径瓶颈，为苏氨酸工业菌株的理性改造提供了重要依据。

创新点

系统比较了hom、homFBR、thrB、thrC不同基因组合的过表达效应；发现同时扩增抗反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶可完全将碳流从赖氨酸转向苏氨酸；证明了苏氨酸合酶反应不是限速步骤。

研究对象（10）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 threonine biosynthesis hom, thrB homoserine dehydrogenase (HDH), homoserine kinase (HK) 催化 野生型，扩增hom-thrB后HDH和HK比活力分别提高约11倍和27倍，但未分泌苏氨酸或赖氨酸。
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 threonine biosynthesis thrC threonine synthase (TS) 催化 扩增thrC使TS比活力提高约8倍，但未影响氨基酸分泌。
Corynebacterium glutamicum DG 52-5 aspartate pathway to lysine/threonine hom-thrB HDH, HK 催化 赖氨酸生产菌，过表达hom-thrB后赖氨酸从22.7 mM降至7.0 mM，苏氨酸达到14.0 mM。
Corynebacterium glutamicum DG 52-5 aspartate pathway to lysine/threonine thrC threonine synthase (TS) 催化 过表达thrC对苏氨酸或赖氨酸生成无影响。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 threonine and lysine biosynthesis hom-thrB HDH, HK 催化 苏氨酸产量由6.3 mM升至8.3 mM，赖氨酸由7.2 mM降至3.8 mM。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 threonine biosynthesis homFBR feedback-resistant homoserine dehydrogenase 催化 单独表达homFBR导致积累12.3 mM高丝氨酸，赖氨酸降至0.1 mM，苏氨酸约7.5 mM。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 threonine biosynthesis homFBR-thrB feedback-resistant HDH, HK 催化 苏氨酸产量达14.1 mM，赖氨酸0.1 mM，无高丝氨酸积累。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 threonine biosynthesis homFBR-thrB+C HDH, HK, TS 催化 苏氨酸14.2 mM，赖氨酸0.1 mM，与homFBR-thrB结果相似，TS过表达无额外影响。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 threonine biosynthesis thrC threonine synthase (TS) 催化 过表达thrC对苏氨酸和赖氨酸产量无明显影响。
Corynebacterium glutamicum DM 368-3 aspartate pathway lysC FBR (suggested) aspartate kinase 催化 作者建议引入抗反馈抑制的天冬氨酸激酶以解除整体途径的限速瓶颈，未实际克隆表达。

关键发现

  1. 所有重组菌株的高丝氨酸脱氢酶（HDH）、高丝氨酸激酶（HK）和苏氨酸合酶（TS）比活力分别提高8-12倍、15-25倍和8-12倍
  2. 野生型C. glutamicum 13032扩增苏氨酸基因后不分泌苏氨酸或赖氨酸
  3. 赖氨酸生产菌DG 52-5（分泌22.7 mM赖氨酸）过表达hom-thrB后赖氨酸降至7.0 mM，同时产生14.0 mM苏氨酸
  4. DM 368-3（本身分泌6.3 mM苏氨酸和7.2 mM赖氨酸）过表达hom-thrB后苏氨酸增至8.3 mM、赖氨酸降至3.8 mM
  5. 单独过表达homFBR导致DM 368-3积累12.3 mM高丝氨酸，赖氨酸几乎为零
  6. 过表达homFBR-thrB使DM 368-3产生14.1 mM苏氨酸且无高丝氨酸积累
  7. 过表达thrC（单独或组合）对苏氨酸/赖氨酸生成无影响
  8. 重组菌株生长变慢，倍增时间由100 min延至200 min。

研究结论

在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶是碳流进入天冬氨酸家族途径的关键限速点；为高效生产苏氨酸，必须同时扩增抗反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶，而苏氨酸合酶过表达无益；建议将编码抗反馈抑制天冬氨酸激酶的lysC FBR与homFBR-thrB组合导入以突破途径瓶颈。