Characterization and evaluation of a pta (phosphotransacetylase) negative mutant of Escherichia coli HB101 as production host of foreign lipase
- 作者
- D. H. Hahm, J. Pan, J. S. Rhee
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00170231
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估pta（磷酸转乙酰酶）阴性突变的大肠杆菌HB101作为外源脂肪酶生产宿主的潜力，解决乙酸积累导致的生长抑制和重组蛋白产量下降问题。
研究策略
构建pta插入突变体PN101阻断乙酸合成途径，系统研究其在不同碳源下的生长特性、氧化还原敏感性、外源脂肪酶表达水平及高细胞密度培养性能。
研究路线图
核心内容
本研究通过插入突变失活大肠杆菌HB101的pta基因（编码磷酸转乙酰酶），构建了阻断乙酸合成途径的突变株PN101，系统评估其作为外源脂肪酶生产宿主的潜力。以葡萄糖、甘露糖、甘油为碳源时，PN101最大比生长速率较亲本分别降低约30%（如葡萄糖从0.90降至0.64 h⁻¹），而以乙酸、琥珀酸等有机酸为碳源时生长速率反而提高约20%。发酵中PN101乙酸积累仅约0.14 g/L，远低于亲本的0.33 g/L。高细胞密度培养中，菌体干重可达75 g/L，乙酸仅约1 g/L，且不产生D-乳酸和丙酮酸。外源脂肪酶经IPTG诱导4小时表达量约为总蛋白的10–15%，与亲本相当。补充表达乳酸乳球菌乳酸脱氢酶基因可恢复生长缺陷并降低对甲萘醌的敏感性，显示生长抑制与胞内氧化还原失衡相关，阻断乙酸途径仅造成约9%的能量缺乏。结果表明，pta突变株虽在糖类碳源下存在生长减慢，但乙酸积累低、高密度培养易实现且蛋白表达水平不受损，是便捷通用的重组蛋白生产宿主。
创新点
首次全面表征pta突变株作为表达宿主的特性；发现生长缺陷与胞内氧化还原平衡紧密相关；证明该突变株无需精细葡萄糖补料即可实现高细胞密度培养并保持低乙酸积累。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli HB101 | 乙酸合成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 通过TnphoA插入突变失活，构建pta阴性突变株PN101，阻断乙酸合成主要途径 |
| Escherichia coli HB101 | 乙酸合成途径 | ackA | 乙酸激酶 | 催化 | 与pta共同构成主要乙酸合成途径，本文未突变但提及作为对照 |
| Escherichia coli HB101 / PN101 | 重组蛋白表达 | lipase gene from Pseudomonas fluorescens SIK W1 | 脂肪酶 | 催化 | 由tac启动子控制，IPTG诱导表达，以包涵体形式积累，表达水平与亲本相当 |
| Escherichia coli PN101 (pta-) | 乳酸发酵 | ldhL from Lactobacillus casei | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 表达后可恢复pta突变株的生长缺陷并对甲萘醌不敏感，但L-乳酸未分泌至胞外 |
关键发现
- 以葡萄糖、甘露糖、甘油为碳源时，pta突变株PN101最大比生长速率较亲本HB101分别降低约30%（0.90→0.64 h⁻¹，0.98→0.69 h⁻¹，0.82→0.57 h⁻¹）
- 以乙酸、琥珀酸、苹果酸为碳源时生长速率反而提高约20%（0.40→0.52 h⁻¹，0.38→0.45 h⁻¹，0.46→0.64 h⁻¹）。亲本HB101发酵中乙酸最大积累0.33 g/L，而PN101仅约0.14 g/L。高细胞密度培养中，DCW达75 g/L，乙酸仅约1 g/L，不产生D-乳酸和丙酮酸。脂肪酶经IPTG诱导4 h表达量约为总蛋白的10-15%（最佳约40%未达到）。表达L. casei乳酸脱氢酶基因后生长缺陷恢复且对甲萘醌不敏感。阻断乙酸途径仅造成约9%的能量缺乏。
研究结论
pta突变株虽有在葡萄糖等碳源下的生长缺陷（约30%降低），但乙酸积累低、高密度培养易实现，外源脂肪酶表达水平与亲本相当，是一种方便且通用的重组蛋白生产宿主。