Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- C. Lang, A. C. Looman
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1995）
- DOI
- 10.1007/BF00164494
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中高效表达和分泌黑曲霉RH5344内切多聚半乳糖醛酸酶，提高重组酶的产量和稳定性。
研究策略
通过去除cDNA的5'和3'同聚物尾、缩短酵母ADHI启动子、删除表达质粒中的细菌序列构建酵母-only质粒，比较真菌信号肽与酵母α-因子信号肽的分泌效率，并采用补料分批发酵提高产量。
核心内容
该研究在酿酒酵母AH22中实现了黑曲霉RH5344内切多聚半乳糖醛酸酶的高效表达与分泌。研究者通过去除cDNA的5'和3'同聚物尾、缩短酵母ADHI启动子，并删除表达质粒中的细菌序列构建酵母-only质粒pPG6，显著提升了质粒的有丝分裂稳定性和酶产量。短启动子使PG产量从1200 U/ml提升至3000 U/ml，去除细菌序列后进一步增至7000 U/ml，补料分批发酵最高达到45000 U/ml。黑曲霉自身信号肽在酵母中能正确加工并高效指导分泌，重组酶占总分泌蛋白的89%，摇瓶和补料分批分泌浓度分别为22 mg/L和200 mg/L。重组酶分子量38.4 kDa，去糖基化后与真菌酶同为35.5 kDa，其糖基化程度更高，热稳定性显著优于天然酶：40°C处理1小时保留95%活性而真菌酶仅保留65%，50°C时重组酶仍保留15%活性，真菌酶则完全失活。结果表明，通过启动子优化、质粒稳定性改造和发酵策略相结合，可在酿酒酵母中高效生产且热稳定性更佳的食品级多聚半乳糖醛酸酶。
创新点
1. 去除质粒中大部分细菌序列构建酵母-only质粒，显著提高有丝分裂稳定性和产量；2. 黑曲霉自身信号肽在酿酒酵母中高效指导分泌且加工位点正确；3. 酵母来源的重组酶糖基化程度更高，热稳定性显著优于天然真菌酶。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae AH22 | 果胶降解（多聚半乳糖醛酸水解） | polygalacturonase cDNA (pga) | 内切多聚半乳糖醛酸酶 (EC 3.2.1.15) | 催化 | 来自黑曲霉RH5344，由ADHI启动子驱动表达 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22 | — | ADHI promoter (short version) | — | 调控 | 去除上游调控序列后表达量提高2.5倍 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22 | 分泌途径 | Aspergillus niger PG leader sequence | PG信号肽 | 转运 | 在酵母中正确加工并高效分泌 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22 | 分泌途径 | α-factor leader sequence (MFα1) | α-因子前导肽 | 转运 | 替代信号肽，但分泌量较低（800 U/ml） |
关键发现
- 缩短ADHI启动子使PG产量从1200 U/ml提高到3000 U/ml（2.5倍）
- 删除细菌序列构建pPG6后产量进一步提高到7000 U/ml（2.3倍）
- 补料分批发酵最高达45000 U/ml。摇瓶培养分泌PG浓度为22 mg/L，补料分批为200 mg/L，PG占总分泌蛋白的89%。重组酶分子量为38.4 kDa，真菌酶为37.3 kDa，去糖基化后均为35.5 kDa
- 等电点为pH 5.7。热稳定性：40°C处理1h后重组酶保留95%活性，真菌酶保留65%
- 50°C处理1h重组酶保留15%，真菌酶完全失活。pH最适为5-6，温度最适为50°C。
研究结论
成功在酿酒酵母中高效表达和分泌黑曲霉多聚半乳糖醛酸酶，通过启动子优化、质粒稳定性改造和发酵策略，产量显著提升，且酵母来源酶热稳定性更好，适合食品级酶的生产。