Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10
- 作者
- A. Galkin, L. Kulakova, V. Tishkov, N. Esaki, K. Soda
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1995）
- DOI
- 10.1007/BF00169947
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆甲醇利用细菌Mycobacterium vaccae N10的甲酸脱氢酶（FDH）基因，并通过定点突变揭示其热稳定性低于Pseudomonas sp. 101 FDH的分子机制。
研究策略
采用简并引物PCR扩增FDH基因片段，Southern杂交筛选基因组文库克隆全长基因；通过序列比对和定点突变（E61Q、E61P、E61K）分析关键氨基酸对热稳定性的影响。
研究路线图
核心内容
从甲醇利用菌株Mycobacterium vaccae N10中克隆并测序了甲酸脱氢酶（McFDH）基因，其开放阅读框长1200 bp，编码400个氨基酸。通过简并引物PCR和Southern杂交筛选基因组文库获得全长序列，McFDH与Pseudomonas sp. 101的FDH（PsFDH）在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别高达99%和99.5%。McFDH在大肠杆菌中表达量约占可溶性蛋白的2%，其催化性质与PsFDH几乎一致，kcat均为10 s⁻¹，甲酸Km分别为6.0 mM和6.5 mM，NAD⁺ Km分别为0.09 mM和0.08 mM，但热稳定性显著更低，失活速率常数k_inact分别为3.5×10⁻² min⁻¹和1.1×10⁻² min⁻¹。基于序列差异设计了E61Q、E61P和E61K三个定点突变，其k_inact分别降至2.3×10⁻²、1.3×10⁻²和1.4×10⁻² min⁻¹，其中E61P和E61K已达到PsFDH水平。结果表明第61位谷氨酸的负电荷引起的静电排斥是McFDH热不稳定的主要原因，而引入脯氨酸还可通过降低构象熵进一步增强稳定性。
创新点
首次从M. vaccae N10克隆并测序FDH基因；发现仅两个氨基酸差异（第35和61位）导致热稳定性不同；证明第61位谷氨酸的负电荷是降低热稳定性的主要原因。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TG1 | 甲酸氧化与NADH再生 | fdh (McFDH) | 甲酸脱氢酶 McFDH | 催化 | 克隆表达宿主，IPTG诱导表达，重组蛋白占可溶性蛋白约2% |
| Mycobacterium vaccae N10 | 甲醇利用途径 | fdh | 甲酸脱氢酶 McFDH | 催化 | FDH基因来源菌株 |
| Pseudomonas sp. 101 | 甲酸氧化 | fdh | 甲酸脱氢酶 PsFDH | 催化 | 对比酶，与McFDH仅有第35和61位氨基酸差异 |
关键发现
- McFDH基因ORF为1200 bp，编码400个氨基酸
- 与PsFDH的核苷酸序列一致性为99%，氨基酸序列一致性为99.5%。McFDH在E. coli中表达量约为总可溶性蛋白的2%。两者催化性质相似：kcat均为10 s^-1，Km formate分别为6.0 mM（McFDH）和6.5 mM（PsFDH），Km NAD+分别为0.09 mM和0.08 mM。热稳定性方面，McFDH的失活速率常数k_inact为3.5×10^-2 min^-1，而PsFDH为1.1×10^-2 min^-1。定点突变E61Q、E61P和E61K的k_inact分别为2.3×10^-2、1.3×10^-2和1.4×10^-2 min^-1，均比野生型McFDH更稳定，其中E61P和E61K与PsFDH相当。
研究结论
McFDH与PsFDH催化性质相似，但热稳定性更低；第61位谷氨酸与第43位天冬氨酸的静电排斥导致结构不稳定，将其突变为赖氨酸或脯氨酸可显著提高热稳定性，且脯氨酸通过降低构象熵进一步增加稳定性。