Overproduction of mannitol dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides
- 作者
- K. H. Schneider, F. Giffhorn
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00178493
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
甘露醇脱氢酶（MDH）在生物技术应用（酶法测定、生物传感器、酶法合成）中需要大量供应，但野生型Rhodobacter sphaeroides Si4的酶产量较低，难以满足应用需求。
研究策略
构建携带mtlK基因的宽宿主范围表达载体pAK82，在Rhodobacter sphaeroides Si4中同源过表达甘露醇脱氢酶；并通过补料分批发酵提高细胞密度，从而进一步提升酶产量。
研究路线图
核心内容
针对野生型Rhodobacter sphaeroides Si4甘露醇脱氢酶产量低、难以满足生物技术应用需求的问题，本研究构建了携带mtlK基因的宽宿主范围表达载体pAK82，并在该菌株中进行同源过表达。重组菌株Si4[pAK82]的MDH比活达到0.48 U/mg，是野生型（0.14 U/mg）的3.4倍，对D-阿拉伯醇和D-葡萄糖醇的比活也分别提高了3.5倍和3.0倍。在批式发酵中，重组菌株MDH产量为350 U/L，较野生型的110 U/L提高3.2倍。进一步采用补料分批发酵策略，使OD650达到27.6，细胞干重16.6 g/L，MDH产量达到918 U/L，较野生型批式发酵提高8.3倍，且发酵时间仅40小时。相比之下，在E. coli JE85中异源表达MDH比活仅有0.08 U/mg，低于R. sphaeroides野生型水平。该研究通过同源过表达结合补料分批发酵，建立了一套高效生产甘露醇脱氢酶的方法，为酶法测定、生物传感器等应用提供了充足的酶源。
创新点
首次在Rhodobacter sphaeroides中通过质粒pAK82过表达mtlK基因，使MDH比活提高3.4倍；结合补料分批发酵策略，将酶产量从野生型批式发酵的110 U/L提升至918 U/L，提高8.3倍。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodobacter sphaeroides Si4 | 多元醇代谢（D-甘露醇、D-阿拉伯醇、D-葡萄糖醇氧化为相应酮糖） | mtlK | 甘露醇脱氢酶（MDH, EC 1.1.1.67） | 催化 | 重组菌株Si4[pAK82]携带质粒pAK82（mtlK受lac启动子控制），MDH比活较野生型提高3.4倍 |
| Escherichia coli JE85 | 多元醇代谢（异源表达） | mtlK | 甘露醇脱氢酶（MDH, EC 1.1.1.67） | 催化 | 通过pAK77（tac启动子）异源表达，但比活仅0.08 U/mg，低于R. sphaeroides野生型 |
| Escherichia coli HB101 (pRK2013) | 质粒接合转移辅助功能 | — | — | 调控 | 作为三亲本杂交的辅助菌株，提供转移功能（Tra） |
关键发现
- 重组菌株R. sphaeroides Si4[pAK82]的MDH比活为0.48 U/mg，是野生型（0.14 U/mg）的3.4倍
- 对D-阿拉伯醇和D-葡萄糖醇的比活分别提高3.5倍和3.0倍。批式发酵中，重组菌株MDH产量为350 U/L，较野生型110 U/L提高3.2倍。补料分批发酵中，OD650达到27.6，干重16.6 g/L，MDH产量达918 U/L，较野生型批式发酵提高8.3倍，且发酵时间仅40 h。在E. coli JE85[pAK77]中异源表达MDH比活仅0.08 U/mg，低于R. sphaeroides野生型。
研究结论
通过在Rhodobacter sphaeroides中同源过表达mtlK基因并采用补料分批发酵，成功建立了高效生产甘露醇脱氢酶的方法，为酶的多种应用提供了足够的酶量。