Cauliflower mosaic virus promoters direct efficient expression of a bacterial G418 resistance gene in Schizosaccharomyces pombe
- 作者
- Hans Gmünder, Jürg Kohli
- 单位
- Institute of General Microbiology, University of Bern
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1989）
- DOI
- 10.1007/BF00260862
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 中缺乏不依赖特定营养缺陷突变、可直接选择的抗性筛选标记，需要开发基于 G418 抗性的转化系统。
研究策略
将来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的 35S 和 19S 启动子及终止子与细菌转座子 Tn5 的 G418 抗性基因（氨基糖苷 3'-磷酸转移酶 II）组合，构建自主复制和整合型载体，转化裂殖酵母，考察不同启动子驱动的抗性表达水平。
核心内容
该研究在裂殖酵母中验证了花椰菜花叶病毒（CaMV）35S和19S启动子驱动细菌G418抗性基因表达的能力，旨在建立不依赖营养缺陷突变、可直接选择的抗性筛选系统。研究者将CaMV启动子及终止子与Tn5转座子的氨基糖苷3'-磷酸转移酶II基因组合，构建自主复制与整合型载体并转化裂殖酵母，比较不同启动子驱动的抗性水平。结果显示，35S启动子驱动的抗性达到1 mg/ml G418，与强启动子adh1相当；19S启动子仅在约100 μg/ml低浓度下有效，且抗性依赖基因方向；无启动子对照不产生抗性。整合型单拷贝35S构建在1000 μg/ml G418下获得42至89个抗性菌落每2×10^7细胞，而19S构建在200 μg/ml下仅得11个菌落。该工作首次证明植物病毒启动子可在裂殖酵母中高效驱动外源基因表达，为裂殖酵母提供了不依赖宿主突变的通用G418筛选标记，同时为植物基因在该宿主中的功能表达奠定了基础。
创新点
首次证明 CaMV 植物病毒启动子能在裂殖酵母中高效驱动细菌抗性基因表达；实现了不依赖酵母突变的 G418 直接筛选；单个拷贝的 35S 启动子构建即可赋予高达 1 mg/ml 的 G418 抗性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizosaccharomyces pombe | G418 抗性筛选 | aph(3')-II (neo) 来自 Tn5 | 氨基糖苷 3'-磷酸转移酶(II) | 催化 | 通过磷酸化灭活 G418 抗生素 |
| Schizosaccharomyces pombe | 花椰菜花叶病毒基因表达调控 | 35S 启动子 | — | 调控 | CaMV 35S RNA 启动子，强启动子，驱动抗性基因表达 |
| Schizosaccharomyces pombe | 花椰菜花叶病毒基因表达调控 | 19S 启动子 | — | 调控 | CaMV 19S RNA 启动子，弱于 35S，且活性受方向影响 |
| Schizosaccharomyces pombe | 乙醇脱氢酶代谢 | adh1 启动子 | — | 调控 | 裂殖酵母强启动子，作为对照，其驱动的抗性与 35S 相当 |
| Escherichia coli | 质粒复制 | ars1 | — | 调控 | 裂殖酵母自主复制序列，用于穿梭质粒在酵母中 high frequency 转化 |
| Schizosaccharomyces pombe | 嘧啶合成 | ura4 | — | 催化 | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶，用于 Ura 筛选和基因替换 |
| Schizosaccharomyces pombe | 染色体 III 整合 | ura4 位点 | — | 区室化 | 通过同源重组将抗性基因单拷贝整合到染色体 III ura4 位点 |
| Schizosaccharomyces pombe | 转化 | Tn5 抗性基因无启动子对照 | — | 调控 | 缺少启动子的对照构建，不产生 G418 抗性 |
关键发现
- 35S 启动子驱动的 G418 抗性达到 1 mg/ml，与强启动子 adh1 相当
- 19S 启动子仅在低浓度（100 μg/ml 左右）下有效，且抗性依赖基因方向
- 无启动子的对照质粒不产生任何抗性
- 整合型单拷贝 35S 构建在 1000 μg/ml G418 下获得 42-89 个抗性菌落/2×10^7 细胞
- 19S 构建在 200 μg/ml 下获得 11 个菌落，在 100 μg/ml 下获得 99 个菌落（ABD 方向），而 DBA 方向只在 100 μg/ml 下得到 1 个菌落
- 野生型菌株在 100 μg/ml 以上 G418 浓度不形成菌落。
研究结论
CaMV 35S 启动子可作为裂殖酵母的强启动子，其驱动的 G418 抗性标记可作为不依赖宿主突变的通用筛选标记，且该表达系统可用于植物基因在裂殖酵母中的表达。