Transcriptional Control of the Saccharomyces cerevisiae ADH1 Gene by Autonomously Replicating Sequence Binding Factor 1
- 作者
- Hae Yong Yoo, So Young Jung, Young Ho Kim, Jiyoung Kim, Guhung Jung, Hyune Mo Rho
- 单位
- Department of Molecular Biology and Research Center for Cell Differentiation, Seoul National University; Department of Genetic Engineering, Kyung Hee University; Department of Biology Education, Seoul National University
- DOI
- 10.1007/BF00293548
- 所属领域
- 基因表达调控
- 关键词
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解决的核心问题
解析ABF1通过启动子和编码区内的结合位点调控酵母ADH1基因表达的机制及碳源依赖性
研究策略
构建ADH1-lacZ融合质粒，通过缺失和定点突变分析ABF1结合位点的功能；利用凝胶迁移率变动实验检测ABF1与结合位点的体外结合；将合成ABF1结合位点插入CYC1-lacZ无UAS载体中验证其独立激活能力
核心内容
该研究系统解析了酿酒酵母中ARS结合因子1（ABF1）通过启动子区和编码区内的结合位点调控乙醇脱氢酶基因ADH1转录的机制。研究者构建ADH1-lacZ融合报告质粒，通过缺失和定点突变分析两个ABF1结合位点的功能，并利用凝胶迁移率变动实验验证ABF1与这些位点的体外结合；同时将合成的ABF1结合位点插入无激活序列的CYC1-lacZ载体，检验其独立激活能力。结果显示，删除启动子区ABF1结合位点使β-半乳糖苷酶活性降低4.7倍，删除编码区结合位点使活性降低2.2倍；在ABF1温敏突变株中过表达ABF1后，含完整激活序列的报告质粒在葡萄糖培养基中活性提高4.8倍，甘油培养基中提高8.7倍，而突变两个结合位点则几乎消除该激活效应；人工插入的ABF1结合位点能使报告基因活性提高3.8至7.8倍，且反向插入时活性相近，表明其以方向非依赖方式起作用。该研究首次证实ADH1编码区内的ABF1结合位点具有转录激活功能，两个位点协同作用并介导碳源依赖性的转录调控，加深了对酵母中ABF1作为多功能转录因子参与代谢基因调控机制的理解。
创新点
首次证明ADH1编码区内的ABF1结合位点具有转录激活功能，且两个ABF1结合位点协同激活ADH1；ABF1结合位点以方向非依赖方式起作用；激活程度受碳源影响
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇发酵/糖酵解 | ADH1 | 乙醇脱氢酶1 | 催化 | 目标基因，含有两个ABF1结合位点（启动子和编码区） |
| Saccharomyces cerevisiae | 基因表达调控 | ABF1 | ARS结合因子1 | 调控 | 转录激活因子，可结合ADH1启动子和编码区内的位点 |
| Saccharomyces cerevisiae | 基因表达调控 | CYC1 | 细胞色素c | 能量供给 | 用作无UAS的lacZ报告基因载体，插入ABF1结合位点 |
| Escherichia coli | 报告基因 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 报告基因，用于检测转录活性 |
关键发现
- 删除启动子ABF1结合位点区(-717~-410)导致β-半乳糖苷酶活性降低4.7倍
- 删除编码区(+109~+761)使活性降低2.2倍
- 在ABF1温敏突变株JCA35(abf1-5)中过表达ABF1后，pADH01的β-半乳糖苷酶活性在葡萄糖培养基中提高4.8倍、甘油培养基中提高8.7倍
- pADH02分别提高2.6倍和5.4倍
- pADH03分别提高3.8倍和9.2倍
- pADH04仅提高1.5倍和1.8倍
- 定点突变两个ABF1结合位点均使活性降低约2倍并消除ABF1的激活效应
- 人工ABF1结合位点插入CYC1-lacZ后，在葡萄糖培养基中使活性提高3.8倍，甘油培养基中提高7.8倍，且反向插入时活性相近
研究结论
ABF1通过启动子和编码区内两个ABF1结合位点反式激活ADH1基因，两个位点起协同作用，并介导碳源依赖性转录调控。