Biosynthesis regulation of the \(\beta\) -glucosidase produced by a yeast strain transformed by genetic engineering
- 作者
- M. Leclerc, P. Chemardin, A. Arnaud, R. Ratomahenina, P. Galzy, C. Gerbaud, A. Raynal
- 单位
- Chaire de Génétique et Microbiologie ENSA-INRA, Place Viala, F-34060 Montpellier Cedex, France; B.G.M., Bât. 400, Université de Paris-Sud 91405 Orsay Cedex, France
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1987）
- DOI
- 10.1007/BF00402336
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决木质纤维素生产乙醇中纤维二糖积累抑制纤维素酶的问题，需要获得高产β-葡萄糖苷酶且能发酵纤维二糖的酵母菌株，但重组酵母虽表达高酶活却无法厌氧发酵纤维二糖，需阐明其原因。
研究策略
将克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）的β-葡萄糖苷酶结构基因克隆到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建重组菌株TYKF2，通过比较不同碳源下的酶活、厌氧发酵实验及瓦氏呼吸实验，研究酶合成调控和纤维二糖发酵受阻的原因。
研究路线图
核心内容
研究将克鲁维酵母的β-葡萄糖苷酶结构基因克隆至酿酒酵母，构建重组菌株TYKF2，以阐明其高酶活却无法厌氧发酵纤维二糖的原因。通过比较不同碳源下的酶活、厌氧发酵实验及瓦氏呼吸实验发现：以纤维二糖5 g/L和50 g/L培养时，TYKF2酶活分别为5.8和6.9 I.U.，远高于供体菌K. fragilis Y610的0.025和0.051 I.U.；但以葡萄糖为碳源时酶活受抑制，表明该酶合成不受纤维二糖诱导而受葡萄糖浓度升高抑制。厌氧条件下，TYKF2可完全消耗60 g/L葡萄糖，但同浓度纤维二糖仅消耗4 g/L，酒精产量可忽略；瓦氏呼吸实验显示厌氧时以纤维二糖为底物不产生CO2，加入葡萄糖后恢复产气，而有氧条件下纤维二糖可被氧化代谢。结论表明重组菌无法厌氧发酵纤维二糖并非酶合成不足，而是纤维二糖转运依赖呼吸链供能（Kluyver效应），这为解析重组酵母中纤维二糖利用瓶颈提供了关键机制依据。
创新点
首次在酿酒酵母中异源表达K. fragilis β-葡萄糖苷酶基因，证明其调控机制与供体菌一致；发现重组菌株纤维二糖发酵受阻归因于呼吸链依赖的转运能量需求（Kluyver效应），而非酶合成不足。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae TYKF2 | 纤维二糖降解/乙醇发酵 | β-葡萄糖苷酶结构基因（来自Kluyveromyces fragilis） | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 重组菌株，异源表达，酶活显著高于供体菌（纤维二糖5 g/L时5.8 I.U. vs 0.025 I.U.） |
| Kluyveromyces fragilis Y610 | 纤维二糖降解 | β-葡萄糖苷酶结构基因 | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 供体菌，天然酶活较低 |
| Saccharomyces cerevisiae TYKF2 | 呼吸链/能量代谢 | — | — | 能量供给 | 纤维二糖转运依赖呼吸链供能，阻断呼吸则不能发酵纤维二糖 |
关键发现
- 在重组酵母TYKF2中，以纤维二糖5 g/L和50 g/L培养时β-葡萄糖苷酶活分别为5.8和6.9 I.U.，而供体菌K. fragilis Y610仅为0.025和0.051 I.U.
- 以葡萄糖5 g/L和50 g/L培养时，TYKF2酶活为4.8和2.5 I.U.，Y610为0.006和0.003 I.U.
- 以甘油10 g/L和甲基-β-D-葡萄糖5 g/L培养时，TYKF2酶活为6.0和9.0 I.U.，Y610为0.047和0.055 I.U.。TYKF2以纤维二糖为碳源时的生长速率为0.15 h^-1。厌氧发酵中，葡萄糖60 g/L在24 h内完全消耗，而相同浓度纤维二糖仅消耗4 g/L，细胞数仅翻倍至60×10^6 cells/mL，酒精产量可忽略。厌氧条件下培养的TYKF2细胞β-葡萄糖苷酶活性约为5 I.U.，与有氧条件相似。Warburg实验表明，厌氧时细胞以纤维二糖为底物不产生CO2，加入葡萄糖后恢复产气
- 有氧时纤维二糖可被氧化代谢但发酵缓慢，加入氰化钾或转厌氧后CO2停止，再加葡萄糖又恢复。
研究结论
重组酵母TYKF2中β-葡萄糖苷酶合成不受纤维二糖诱导，但受葡萄糖浓度升高抑制；该菌在有氧条件下可利用纤维二糖，但厌氧条件下不能发酵纤维二糖，原因是纤维二糖转运需要呼吸链供能。