Nucleotide sequence of the tryptophan decarboxylase gene of Catharanthus roseus and expression of tdc-gusA gene fusions in Nicotiana tabacum
- 作者
- Oscar J.M. Goddijn, Frans P. Lohman, Rolf J. de Kam, Rob A. Schilperoort, J. Harry C. Hoge
- 单位
- Institute of Molecular Plant Sciences, Leiden University, Clusius Laboratory, Wassenaarseweg 64, NL-2333 AL Leiden, The Netherlands
- 杂志
- Plant Molecular Biology（1993）
- DOI
- 10.1007/BF00391016
- 所属领域
- 植物分子生物学与代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析长春花中色氨酸脱羧酶（TDC）基因的核苷酸序列及其启动子的表达调控机制，明确tdc基因在植物次生代谢中的表达特性及响应信号（如生长素、激发子）的调控元件。
研究策略
通过Southern blot确定tdc基因拷贝数；构建并筛选基因组文库，克隆并测序tdc基因；将tdc启动子5'端系列缺失片段与gusA报告基因构建翻译融合载体，通过农杆菌介导转化烟草进行稳定表达分析，并通过原生质体瞬时表达分析启动子活性及生长素（NAA）的影响。
研究路线图
核心内容
该研究首次报道了长春花色氨酸脱羧酶（TDC）编码基因的完整核苷酸序列，并系统解析了其启动子的表达调控机制。通过Southern blot证实tdc为单拷贝基因，且无内含子，其序列与cDNA完全一致。研究者构建了tdc启动子5'端系列缺失片段与gusA报告基因的翻译融合载体，经农杆菌介导稳定转化烟草及原生质体瞬时表达分析发现：1938 bp启动子可在烟草根、茎、叶中驱动GUS非组织特异性表达；缺失至-398时表达水平降低但模式不变，缺失至-232时稳定转化体GUS活性几乎消失，表明-1938至-658区间存在增强元件、-398至-232区间含基础表达元件。瞬时表达中，-891、-658、-398和-232启动子的GUS活性分别为11.7、8.9、4.9和2.4 nmol/min/mg蛋白，且NAA处理无显著影响。值得注意的是，瞬时体系中-232启动子仍具活性，与稳定转化结果不同，提示原生质体状态可能通过激发子效应激活该启动子。此外，长春花根中tdc mRNA水平比叶片高5-10倍。这些结果为理解TIA生物合成途径的转录调控及其异源表达策略提供了关键序列信息。
创新点
['首次报道长春花tdc基因的完整核苷酸序列，证明其为单拷贝且无内含子', "通过启动子5'缺失分析定位了增强子元件（-1938至-658）和基础表达元件（-398至-232）", '发现瞬时表达系统中-232启动子仍具活性，与稳定转化结果不同，提示原生质体条件可能存在激发子效应']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | tdc | TDC（色氨酸脱羧酶，EC 4.1.1.28） | 催化 | 将色氨酸转化为色胺，连接初生代谢与TIA生物合成 |
| Nicotiana tabacum | 异源表达体系 | tdc启动子片段（-1938/-658/-398/-232）与gusA融合 | GUS（β-葡萄糖醛酸酶） | 催化 | 作为报告基因，用于分析tdc启动子活性 |
| Catharanthus roseus | tdc基因转录调控 | tdc启动子 | — | 调控 | 包含ASF-1、GT-1、G-box等推定转录因子结合位点 |
关键发现
- TDC由单拷贝基因编码，tdc基因无内含子且与cDNA序列一致
- 1938 bp启动子驱动GUS在烟草根、茎、叶中表达，无组织特异性
- 启动子缺失至-398时表达水平降低但表达模式不变，缺失至-232时稳定转化体GUS活性几乎消失
- 在瞬时表达中，-891、-658、-398和-232启动子的GUS活性分别为11.7、8.9、4.9和2.4 nmol/min/mg蛋白（无NAA），且NAA处理无显著影响
- C. roseus中tdc mRNA在根中比叶片高5-10倍。
研究结论
长春花tdc基因是单拷贝无内含子基因，其启动子在异源烟草中驱动非组织特异性表达；启动子区域-1938至-658含有增强元件，-398至-232含有基础表达所需元件；瞬时表达与稳定表达的差异提示原生质体状态可能通过激发子效应激活-232启动子。