Cloning of the Gene Cluster Responsible for Biosynthesis of KS-505a (Longestin), a Unique Tetraterpenoid
- 作者
- Yutaka HAYASHI, Hiroyasu ONAKA, Nobuya ITOH, Haruo SETO, Tohru DAIRI
- 单位
- Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University, Toyama 939-0398, Japan; Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Setagaya-ku, Tokyo 156-8502, Japan
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2007）
- DOI
- 10.1271/bbb.70477
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并解析 KS-505a（longestin）——一种独特的环化四萜类化合物的生物合成基因簇，特别是鉴定参与四萜环化的酶。
研究策略
基于保守序列设计 PCR 引物克隆多聚异戊二烯焦磷酸（PPD）合酶基因；通过侧翼序列分析找到推定基因簇；通过基因破坏和重组酶活性验证基因功能。
核心内容
该研究从 Streptomyces argenteolus 中克隆并解析了独特环化四萜类化合物 KS-505a（longestin）的生物合成基因簇。研究者基于保守序列设计 PCR 引物，克隆得到 4 种多聚异戊二烯焦磷酸（PPD）合酶基因片段，其中 opds1 编码约 35 kDa 的 OPD 合酶（Lon12），并通过侧翼序列分析获得长约 28 kb、含 24 个 ORF 的推定基因簇。重组酶活性验证表明，Lon12 以 FDP 和 IPP 为底物时主要产生 OPD（C40）及少量 C45 产物，与大肠杆菌 OPD 合酶不同，它不能利用 DMAPP 但能以 GDP、FDP、GGDP 为烯丙基底物；Lon22 则被鉴定为 GGDP 合酶。基因破坏实验证实，破坏推定的环化酶基因 lon15 后三个突变株均不再产生 KS-505a，而野生型正常产生，证明该基因簇负责其生物合成。推定的环化酶 Lon15 与链霉菌中角鲨烯-藿烯环化酶有 85% 的氨基酸同一性。这是首次报道环化四萜类化合物的生物合成基因簇，并揭示了 OPD 合酶底物特异性的独特性，提示体内底物可能为 GGDP 或 FDP，且四萜环化可能需先连接 o-琥珀酰苯甲酸部分。
创新点
['首次报道环化四萜类化合物（tetraterpenoid）的生物合成基因簇。', '发现次级代谢相关的 OPD 合酶（Lon12）具有独特的底物特异性（不能利用 DMAPP，但能利用 GDP、FDP、GGDP），与大肠杆菌 OPD 合酶不同。', '在基因簇中鉴定到 GGDP 合酶（Lon22），提出 OPD 可能由 GGDP 和 IPP 缩合产生的新机制。']
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon12 | OPD 合酶 (octaprenyl diphosphate synthase) | 催化 | 催化 IPP 与烯丙基底物缩合形成 OPD（C40）；底物特异性为 GDP、FDP、GGDP，非 DMAPP |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon22 | GGDP 合酶 (geranylgeranyl diphosphate synthase) | 催化 | 以 DMAPP 和 IPP 为底物主要产生 GGDP（C20） |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon15 | 推定四萜环化酶 (isoprenoid cyclase) | 催化 | 基因破坏导致 KS-505a 不产生；与角鲨烯-藿烯环化酶有 85% 同一性 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon3 | o-琥珀酰苯甲酸合酶 (o-succinylbenzoate synthase) | 催化 | 参与 α-琥珀酰苯甲酸部分合成 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon9 | 异分支酸合酶 (isochorismate synthase) | 催化 | 参与 α-琥珀酰苯甲酸部分合成 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon7 | 糖基转移酶 (glycosyl transferase) | 催化 | 负责连接葡糖醛酸 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon11 | P450 单加氧酶 | 催化 | 可能参与羟基化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon16 | P450 单加氧酶 | 催化 | 可能参与羟基化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon10 | 甲基转移酶 | 催化 | 参与甲基化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon20 | 甲基转移酶 | 催化 | 参与甲基化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon23 | 甲基转移酶 | 催化 | 参与甲基化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon4 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | MEP 途径基因，可能补充 IPP 合成 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon5 | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 (IspG) | 催化 | MEP 途径基因 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon13 | 4-羟基苯甲酸辛异戊二烯转移酶 | 催化 | 可能参与苯甲酸部分连接 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon14 | FAD-单加氧酶 | 催化 | 可能参与氧化 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon18 | ABC 转运蛋白 (CinH 同源物) | 转运 | 可能参与产物转运 |
| Streptomyces argenteolus | KS-505a 生物合成 | lon19 | ABC 转运蛋白 | 转运 | 可能参与产物转运 |
关键发现
- 从 Streptomyces argenteolus 中克隆到 4 种 PPD 合酶基因片段（opds1-4），其中 opds1 编码 OPD 合酶（Lon12），大小约 35 kDa。重组 Lon12 以 FDP 和 [1-14C]IPP 为底物时主要产生 OPD (C40) 和非异戊二烯焦磷酸 (C45)。重组 Lon22 以 DMAPP 和 IPP 为底物时主要产生香叶基香叶醇 (C20)，表明其为 GGDP 合酶。Lon12 以 GDP、FDP、GGDP 为烯丙基底物时均能产生 OPD，但不能利用 DMAPP
- 而大肠杆菌 OPD 合酶可用 DMAPP、GDP、FDP、GGDP。基因簇长约 28 kb，包含 24 个 ORF（Lon1-24）。破坏环化酶基因 lon15 后，三个破坏株均不产生 KS-505a，野生型产生，证明该基因簇参与 KS-505a 生物合成。推定的环化酶 Lon15 与 S. coelicolor A3(2) 和 S. avermitilis MA-4680 的角鲨烯-藿烯环化酶有 85% 同一性。
研究结论
成功克隆并验证了 KS-505a 生物合成基因簇，包括一个编码 OPD 合酶和两个编码 PPD 合酶的基因；基因破坏证明该基因簇负责 KS-505a 合成；发现 OPD 合酶底物特异性的特殊性，提示体内底物可能是 GGDP 或 FDP；但尚未能在体外检测到四萜环化酶活性，推测环化前可能需要先连接 α-琥珀酰苯甲酸部分。