Molecular Cloning of Menaquinone Biosynthetic Genes of Escherichia coli K12
- 作者
- John R. Guest, Duncan J. Shaw
- 单位
- Department of Microbiology, University of Sheffield, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, U.K.
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1981）
- DOI
- 10.1007/BF00425615
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆大肠杆菌K12中甲萘醌生物合成基因（menB、menC、menD），以揭示其基因结构、排列和功能，并修正早期遗传图谱。
研究策略
利用λ噬菌体插入载体（NM540）构建含HindIII酶切片段的体外重组噬菌体文库，以menC突变体为受体筛选转导噬菌体，再通过互补测试、转导频率分析和限制性酶切/异源双链分析鉴定克隆DNA。
核心内容
该研究通过λ噬菌体插入载体NM540构建大肠杆菌K12基因组HindIII酶切片段的体外重组文库，以menC突变体为受体筛选转导噬菌体，旨在克隆甲萘醌生物合成基因并修正其遗传图谱。经互补测试、转导频率分析和限制性酶切及异源双链分析，获得携带约11.5kb细菌DNA插入片段的λG68转导噬菌体，初始筛选频率约为3×10⁻⁶每pfu。结果表明menB和menC突变株转导频率为1×10⁻³至8×10⁻³每pfu且能被互补，证明这两基因完整克隆并表达；而menD突变株转导频率仅为1×10⁻⁵至3×10⁻⁶或不可检测（<3×10⁻⁹），不被互补，说明仅部分克隆。异源双链分析显示插入片段长度为11.49±0.69kb，载体缺失1.38±0.21kb，基因组杂交进一步将men基因定位于21kb HindIII片段和14.1kb EcoRI片段中。据此重新确定基因顺序为nalA-menC-menB-menD-purF。该工作首次克隆了menCB(D)区域，确立正确基因排列，为后续甲萘醌生物合成途径的生化与调控研究奠定了基础。
创新点
首次克隆了含menCB(D)部分的λ转导噬菌体λG68，证明menB和menC被完整克隆并表达，而menD只部分克隆；重新确定了men基因顺序为menC-menB-menD。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌K12 | 甲萘醌生物合成 | menC | — | 催化 | 编码2-琥珀酰苯甲酸合成步骤相关酶，突变株需外源2-琥珀酰苯甲酸方可厌氧生长；被λG68互补 |
| 大肠杆菌K12 | 甲萘醌生物合成 | menB | — | 催化 | 参与2-琥珀酰苯甲酸转化为1,4-二羟基-2-萘甲酸，突变株需外源DHN；被λG68互补 |
| 大肠杆菌K12 | 甲萘醌生物合成 | menD | — | 催化 | 参与甲萘醌生物合成，突变株需外源2-琥珀酰苯甲酸；λG68仅含其部分基因，未被互补 |
关键发现
- 筛选到λG68转导噬菌体，初始筛选频率约3×10^-6每pfu
- menB和menC突变株转导频率为1×10^-3至8×10^-3每pfu并被互补，menD突变株转导频率为1×10^-5至3×10^-6或不可检测（<3×10^-9）且不被互补。克隆的细菌DNA片段约11.5kb，异源双链显示插入片段11.49±0.69kb，载体缺失1.38±0.21kb
- 基因组杂交显示men基因位于21kb HindIII片段和14.1kb EcoRI片段中。基因顺序为nalA....menC...menB...menD...purF。
研究结论
成功构建了λmenCB(D)转导噬菌体，克隆了menB和menC完整基因及menD部分基因，确立了menC-menB-menD的基因顺序，为后续甲萘醌生物合成途径的生化与调控研究奠定了基础。