Construction of squalene-accumulating Saccharomyces cerevisiae mutants by gene disruption through homologous recombination
- 作者
- N. Kamimura, M. Hidaka, H. Masaki, T. Uozumi
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00902741
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过基因操作获得稳定积累角鲨烯的酿酒酵母菌株，以替代从深海鲨鱼肝脏提取角鲨烯的有限天然资源。
研究策略
利用酿酒酵母高频同源重组的特性，构建含有短酵母染色体DNA片段和LEU2选择标记的整合型质粒库，随机导入酵母基因组进行基因破坏，并通过制霉菌素富集和麦角固醇依赖筛选角鲨烯积累突变株。
核心内容
该研究针对角鲨烯依赖深海鲨鱼肝脏提取的局限，利用酿酒酵母高频同源重组特性，构建含短酵母染色体片段与LEU2标记的整合型质粒库，随机导入基因组实现全基因组规模基因破坏，无需预先锁定靶基因。随后结合制霉菌素富集与麦角固醇依赖筛选，获得两个稳定积累角鲨烯的突变株E13和E16。在需氧培养并补充麦角固醇的条件下，两株菌的角鲨烯积累量均约达5 mg/g干重；指数生长期E13和E16的角鲨烯含量分别为1.33和1.92 mg/g干重，其中E16的麦角固醇含量降至野生型SHY3的约五分之一。Southern杂交与脉冲场电泳显示整合位点位于12号染色体，不同于编码角鲨烯环氧酶的ERG1基因所在的15号染色体。结果表明该法成功构建了稳定产角鲨烯菌株，且12号染色体上可能存在一个参与角鲨烯代谢的新基因，其后续克隆解析有望阐明相关调控机制。
创新点
无需预先知道目标基因，利用随机短片段同源重组实现全基因组规模的基因破坏；结合制霉菌素筛选获得稳定的角鲨烯积累突变株。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SHY3 | 麦角固醇生物合成 | — | — | 调控 | 同源重组破坏了12号染色体上的一个基因，推测为参与角鲨烯代谢的结构基因或调控基因（具体未知）。 |
| Saccharomyces cerevisiae SHY3 | 麦角固醇生物合成 | ERG1 | 角鲨烯环氧酶 | 催化 | 催化角鲨烯转化为2,3-氧化角鲨烯；位于15号染色体，非本研究突变位点。 |
| Saccharomyces cerevisiae SHY3 | 麦角固醇生物合成 | ERG7 | 2,3-氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶 | 催化 | 温度敏感突变体在非允许条件下积累角鲨烯环氧化物而非角鲨烯。 |
| Saccharomyces cerevisiae SHY3 | 麦角固醇生物合成 | LEU2 | β-异丙基苹果酸脱氢酶 | 催化 | 整合型载体上的选择标记，用于筛选转化子。 |
关键发现
- 获得两个稳定积累角鲨烯的突变株E13和E16，在需氧培养并补充麦角固醇的条件下，两株菌的角鲨烯积累量均达到约5 mg/g干重
- 指数生长期时，E13和E16的角鲨烯含量分别为1.33和1.92 mg/g干重，麦角固醇含量分别为0.68和0.23 mg/g干重（野生型SHY3为1.16 mg/g干重），E16的麦角固醇含量仅为野生型的约1/5
- Southern杂交和脉冲场电泳显示整合位点位于12号染色体，与位于15号染色体的ERG1基因不同。
研究结论
通过同源重组随机基因破坏成功构建了稳定的角鲨烯积累酿酒酵母突变株，突变位点位于12号染色体上一个可能参与角鲨烯代谢的新基因，该基因的进一步克隆和序列分析将有助于阐明角鲨烯代谢调控机制。