Overexpression of a tryptophan decarboxylase cDNA in Catharanthus roseus crown gall calluses results in increased tryptamine levels but not in increased terpenoid indole alkaloid production
- 作者
- Oscar J.M. Goddijn, Ed J.M. Pennings, Peter van der Helm, Rob A. Schilperoort, Rob Verpoorte, J. Harry C. Hoge
- 单位
- Institute of Molecular Plant Sciences, Leiden University, Clusius Laboratory, PO Box 9505, 2300 RA Leiden, Netherlands; Center for Bio-Pharmaceutical Sciences, Leiden University, Division of Pharmacognosy, Gorlaeus Laboratory, PO Box 9502, 2300 RA Leiden, Netherlands
- 杂志
- Transgenic Research（1995）
- DOI
- 10.1007/BF01972528
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究色氨酸脱羧酶（TDC）活性是否是长春花冠瘿瘤愈伤组织中萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的限制因素，并验证过表达 tdc cDNA 能否通过提高色胺供应来增加 TIA 产量。
研究策略
构建正义和反义 tdc cDNA 融合 CaMV 35S 启动子/终止子的植物表达载体，通过致癌农杆菌 LBA1010 转化长春花幼苗，获得冠瘿瘤愈伤组织，并分析 TDC 蛋白量、酶活性、色胺含量及 TIA 产量。
研究路线图
核心内容
该研究通过构建正义与反义色氨酸脱羧酶（TDC）cDNA融合CaMV 35S启动子的植物表达载体，利用致癌农杆菌转化长春花幼苗获得冠瘿瘤愈伤组织，系统评估TDC活性是否为萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的限速因素。结果显示，正义tdc转化的愈伤组织中TDC活性高达54–186 pkat/mg蛋白，较空载体对照（4–16 pkat/mg）提升至少10倍，色胺含量最高达5.7 nmol/mg干重，约为对照（0.7–0.9 nmol/mg）的6倍。然而，阿马里新和蛇根碱衍生物的产量并未相应增加，反义转化组织中TDC活性极低且无相关生物碱积累。此外，在未转化细胞悬浮培养和根组织中观察到tdc mRNA水平的显著差异。这些结果明确表明，虽然TDC活性增强可大幅提高色胺供应，但TIA产量未获提升，说明TDC催化的色胺生成并非唯一限速环节，strictosidine合酶活性、secologanin供应或亚细胞定位等因素可能构成下游瓶颈，为多靶点代谢工程的必要性提供了直接证据。
创新点
利用纯化 TDC 蛋白制备抗血清筛选 cDNA 文库，获得 tdc cDNA 并补齐其 5' 端；首次在长春花冠瘿瘤组织中过表达 tdc 正义/反义 cDNA，发现过表达可显著提高 TDC 活性和色胺含量，但 TIA 产量未增加，揭示 TDC 并非唯一限速步骤。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花（Catharanthus roseus）冠瘿瘤愈伤组织 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | tdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 正义过表达（pTDCs）时 TDC 活性 54-186 pkat/mg 蛋白，色胺最高 5.7 nmol/mg 干重；反义表达（pTDCA）时 TDC 活性极低 |
| 长春花（Catharanthus roseus）冠瘿瘤愈伤组织 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | sss | strictosidine 合酶（SSS） | 催化 | 催化色胺与 secologanin 缩合生成 strictosidine，被讨论为 TIA 产量未增加的潜在限速因素 |
| 长春花（Catharanthus roseus）细胞悬浮培养 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | tdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 由 LS 培养基转至诱导培养基后 tdc mRNA 水平升高约 5 倍 |
| 长春花（Catharanthus roseus）根组织 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | tdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 根中 tdc mRNA 水平比悬浮培养高至少 10 倍 |
关键发现
- 在 pTDCs（正义 tdc）转化的冠瘿瘤愈伤组织中，TDC 活性为 54-186 pkat/mg 蛋白，比空载体对照（4-16 pkat/mg 蛋白）高至少 10 倍
- 色胺含量最高达 5.7 nmol/mg 干重，约为对照（0.7-0.9 nmol/mg）的 6 倍。但阿马里新和蛇根碱衍生物的含量在 pTDCs 与对照中相当，未显著增加
- pTDCA（反义）转化组织中 TDC 活性很低或检测不到，且无阿马里新和蛇根碱积累。在未转化细胞悬浮培养中，从 LS 培养基转至诱导培养基后 tdc mRNA 水平约升高 5 倍
- 根中的 tdc mRNA 水平比悬浮培养高至少 10 倍。TDC 蛋白为 47 kDa 单体，N-末端 13 个氨基酸被加工。
研究结论
过表达 tdc cDNA 能显著提高长春花冠瘿瘤愈伤组织的 TDC 活性和色胺积累，但不足以提高 TIA 产量，表明 TDC 催化的色胺生成不是 TIA 生物合成的唯一限速步骤；strictosidine 合酶活性、secologanin 供应、亚细胞定位或肿瘤状态对其他 TIA 基因的抑制等因素可能构成瓶颈。