Regulation of the ribA gene encoding GTP cyclohydrolase II by the soxRS locus in Escherichia coli
- 作者
- Young-Sang Koh, Jenny Choi, Joon-Hee Lee, Jung-Hye Roe
- DOI
- 10.1007/BF02173649
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定受超氧化物应激调控的新基因并阐明其调控机制，重点研究大肠杆菌中受soxRS调节子调控的ribA基因及其在氧化应激中的作用。
研究策略
利用启动子探针质粒pRS415构建随机启动子文库，筛选对超氧化物产生剂百草枯诱导的启动子克隆；通过lacZ融合、λ噬菌体溶原化构建单拷贝融合菌株，结合soxRS/oxyR突变体分析、引物延伸、GTP环化水解酶II活性及黄素含量测定，验证ribA受soxRS调控。
研究路线图
核心内容
该研究利用启动子探针质粒在大肠杆菌中构建随机启动子文库，筛选对超氧化物产生剂百草枯响应的克隆，鉴定出编码GTP环化水解酶II的ribA基因为soxRS调节子的新成员。通过lacZ单拷贝融合、soxRS突变体分析、引物延伸及酶活测定等手段，研究确认ribA转录受超氧化物应激显著诱导：200 μM百草枯处理1小时使β-半乳糖苷酶活性诱导约8倍，且这种诱导完全依赖soxR和soxS的正调控，soxR4组成型突变可使基础活性提高约4倍。百草枯处理使GTP环化水解酶II活性增加约3.2倍，但细胞内黄素、FMN和FAD含量并无变化。该发现表明ribA是soxRS调节子的直接成员，其诱导可能通过增加核黄素合成途径的中间产物参与自由基清除，而非通过改变黄素池总量发挥作用，拓展了对细菌氧化应激防御网络的认识。
创新点
首次发现ribA基因（编码GTP环化水解酶II）是soxRS调节子的新成员，其转录受超氧化物应激诱导，且这种诱导不伴随黄素含量变化，提示其可能具有中间产物介导的抗氧化功能。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (GC4468及衍生菌株) | 核黄素生物合成途径 | ribA | GTP环化水解酶II | 催化 | 核黄素生物合成第一步酶，受soxRS调节子正调控，超氧化物应激下转录和酶活性升高 |
| Escherichia coli | soxRS调节子 | soxR | SoxR | 调控 | 超氧化物感应器，氧化后激活soxS转录，突变为组成型(soxR4)时使ribA基础表达提高约4倍 |
| Escherichia coli | soxRS调节子 | soxS | SoxS | 调控 | 转录激活因子，直接结合ribA启动子区域，其缺失突变消除ribA的诱导 |
关键发现
- 从启动子文库中筛选到2个对100μM百草枯诱导超过2.5倍的启动子克隆，其中一个为ribA启动子
- 在单拷贝lacZ融合菌株中，200μM百草枯处理1h使β-半乳糖苷酶活性诱导约8倍，800μM时达约10倍
- 甲萘醌和胡桃醌也能诱导ribA表达，但过氧化氢、乙醇或热激无显著诱导
- 引入Δsox-8::cat或soxS3::Tn10突变后，百草枯诱导的β-半乳糖苷酶活性显著降低，表明ribA受soxR和soxS正调控；soxR4::cat组成型突变使基础β-半乳糖苷酶活性比野生型高约4倍
- 引物延伸分析确定转录起始位点，主要转录本起始于核糖体起始密码子上游30nt，另有较弱的上游启动子P2；P1启动子转录被百草枯诱导约7倍
- 百草枯处理使野生型菌株GTP环化水解酶II活性增加约3.2倍（从3.6±1.4 U/μg增至11.4±4.4 U/μg），而ΔsoxRS突变体无增加
- 百草枯处理未改变细胞内核黄素、FMN和FAD含量。
研究结论
ribA基因是大肠杆菌soxRS调节子的成员，编码GTP环化水解酶II，在超氧化物应激下其转录和酶活性均显著上调，且完全依赖于soxRS基因座。尽管黄素池未改变，但诱导GTP环化水解酶II可能通过增加合成途径中间产物（如嘧啶类化合物）参与自由基清除或维持合成途径稳定性，从而在氧化应激中发挥作用。