Prospects for the Bioengineering of Isoprenoid Biosynthesis
- 作者
- D. McCaskill, R. Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, PO Box 646340, Pullman, WA 99164-6340 USA
- DOI
- 10.1007/BFb0102064
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过生物工程手段改造植物精油中异戊二烯类次生代谢产物的合成，提高产量或改变组成。
研究策略
系统综述异戊二烯生物合成的酶学、调控和细胞定位，在此基础上提出针对关键酶、代谢通量和毛状体形成的生物工程策略。
研究路线图
核心内容
该文系统综述了植物精油中异戊二烯类次生代谢产物生物合成的酶学基础与调控机制，并在此基础上提出针对关键酶、代谢通量和腺毛发育的生物工程改造策略。文章整合了异戊二烯生物合成途径的区室化研究进展，总结了单萜、倍半萜和二萜环化酶的催化机理及cDNA克隆成果，指出该家族是自然界最大的天然产物类群，已鉴定成员超过22,000种。关键动力学数据显示，植物单萜环化酶催化数普遍较低（0.01–0.3 s⁻¹），而来自Clarkia breweri的S-芳樟醇合酶可达31.6 s⁻¹；留兰香重组(-)-4S-柠檬烯合酶产物中约94%为柠檬烯，其余为微量α-蒎烯、β-蒎烯和月桂烯。不同植物来源的萜类合酶氨基酸一致性约30–40%，且被子植物与裸子植物单萜环化酶在pH适应和阳离子需求上存在显著差异。研究还发现马铃薯HMGR由至少12个基因组成的小家族编码，并鉴定出保守的天冬氨酸富集基序。该综述表明，环化酶机制解析及多个合酶基因的克隆已为定向改造精油组成奠定基础，但对IPP合成调控、途径分流和发育相关调控的理解仍不足，需进一步研究方可实现集成化的精油生物工程。
创新点
整合异戊二烯生物合成酶学、调控及区室化研究，提出基于理性设计的精油生物工程改造方案；总结了单萜/倍半萜/二萜环化酶的机理和克隆进展。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 植物（马铃薯等） | 甲羟戊酸途径 | hmg1/hmg2/hmg3 | HMG-CoA还原酶 (HMGR) | 催化 | 催化HMG-CoA生成甲羟戊酸，是高度调控的限速酶，磷酸化失活 |
| 植物 | 异戊二烯生物合成（IPP代谢） | — | IPP异构酶 | 催化 | 异构化IPP生成DMAPP |
| 葡萄 (Vitis vinifera) 等 | 单萜前体合成 | — | 牻牛儿基二磷酸合酶 (GPP synthase) | 催化 | 催化DMAPP与IPP缩合生成GPP |
| 鸡 (禽类) | 倍半萜/甾醇前体合成 | — | 法尼基二磷酸合酶 (FPP synthase) | 催化 | 催化IPP连续加成生成FPP，晶体结构已解析（2.6 Å） |
| 留兰香 (Mentha spicata) | 单萜生物合成 | limonene synthase cDNA | (-)-4S-柠檬烯合酶 | 催化 | 重组酶产物约94%柠檬烯，次要产物<2%的α-蒎烯、β-蒎烯和月桂烯，含N端质体转运肽 |
| 鼠尾草 (Salvia officinalis) | 单萜生物合成 | — | 龙脑基二磷酸合酶 (bornyl diphosphate synthase) | 催化 | 产生(+)-BPP，与焦磷酸根离子对限制转动 |
| 冷杉 (Abies grandis) | 单萜生物合成 | — | 蒎烯环化酶 (pinene cyclase) | 催化 | 产物(-)-α-蒎烯35%和(-)-β-蒎烯65%（见表1），裸子植物环化酶性质特殊 |
| 薄荷 (Mentha x piperita) | 单萜生物合成 | — | 柠檬烯环化酶 | 催化 | 产生(-)-4S-柠檬烯94%，及少量α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯 |
| 鼠尾草 (Salvia officinalis) | 单萜生物合成 | — | 1,8-桉叶素环化酶 | 催化 | 催化GPP环化并水合生成1,8-桉叶素 |
| 番茄 (Lycopersicon esculentum) | 倍半萜生物合成 | germacrene C synthase cDNA | 大牻牛儿烯C合酶 | 催化 | cDNA已克隆 |
| 广藿香 (Pogostemon cablin) | 倍半萜生物合成 | — | 广藿香醇合酶 | 催化 | 已纯化至均一 |
| 青霉 (Penicillium roqueforti) | 倍半萜生物合成 | aristolochene synthase cDNA | (+)-马兜铃烯合酶 | 催化 | cDNA在大肠杆菌中过表达 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 倍半萜植保素合成 | epi-aristolochene synthase cDNA | 表马兜铃烯合酶 | 催化 | cDNA克隆并在E. coli过表达 |
| 棉 (Gossypium hirsutum) | 倍半萜植保素合成 | δ-cadinene synthase cDNA | (+)-δ-杜松烯合酶 | 催化 | cDNA克隆并在E. coli过表达 |
| 冷杉 (Abies grandis) | 二萜树脂酸合成 | abietadiene cyclase cDNA | 松香二烯环化酶 | 催化 | cDNA克隆并在E. coli表达 |
| 蓖麻 (Ricinus communis) | 二萜植保素合成 | casbene synthase cDNA | 卡斯宾烯合酶 | 催化 | cDNA已分离，转录受诱导调控 |
| 克拉克花 (Clarkia breweri) | 单萜生物合成 | — | S-芳樟醇合酶 | 催化 | 纯化，表观单体76 kDa，转换数31.6 s^-1 |
| 海岸松 (Pinus pinaster) | 倍半萜生物合成 | — | 反式β-金合欢烯合酶 | 催化 | 纯化至表观均一，可能为45 kDa亚基的同源二聚体 |
| 薄荷 (Mentha x piperita) | 单萜次级转化 | — | 细胞色素P450 柠檬烯-3-羟化酶 | 催化 | 催化(-)-4S-柠檬烯C3位羟基化生成(-)-异胡薄荷醇 |
| 留兰香 (Mentha spicata) | 单萜次级转化 | — | 细胞色素P450 柠檬烯-6-羟化酶 | 催化 | 催化柠檬烯C6位羟基化生成(-)-反式香芹醇 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 毛状体发育调控 | GL2 | GL2转录因子 | 调控 | 调控毛状体起始，可能用于增加腺毛密度 |
| 薄荷 (Mentha) | 单萜生物合成 | — | N端质体转运肽 | 区室化 | 柠檬烯合酶前体蛋白含质体转运肽，定位到质体 |
关键发现
- 异戊二烯类化合物是自然界最大的天然产物家族，超过22,000种。单萜环化酶催化数较低，为0.01–0.3 s^-1
- 而来自Clarkia breweri的S-芳樟醇合酶转换数达31.6 s^-1。留兰香(-)-4S-柠檬烯合酶重组酶产物中约94%为柠檬烯，其余<2%各为α-蒎烯、β-蒎烯和月桂烯。植物萜类合酶间氨基酸一致性30–40%，相似性50–60%。被子植物与裸子植物单萜环化酶性质差异显著：被子植物最适pH 6.0–7.2，裸子植物7.5–8.0
- 裸子植物需要K+等一价阳离子，且Mg2+无效。HMGR在植物中由小基因家族编码，马铃薯中至少12个基因。天冬氨酸富集区保守基序为(I,L,V)XDDXX(D,E)。在薄荷突变体643中，柠檬烯C3羟化酶完全取代了C6羟化酶。
研究结论
论文指出，异戊二烯环化酶机制的解析和多种合成酶cDNA的克隆已为系统生物工程改造产物组成和产量奠定基础，但对IPP合成调控、途径分流和发育调控的理解仍不足，需进一步研究才能实现集成化的精油生物工程。