Cloning and Improving the Expression of Pichia stipitis Xylose Reductase Gene in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- ZHENGDAO CHEN, NANCY W. Y. HO
- 单位
- Laboratory of Renewable Resources Engineering, Purdue University, 1295 Potter Center, West Lafayette, IN 47907-1295
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（1993）
- DOI
- 10.1007/BF02918984
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能有效利用木糖生产乙醇，将Pichia stipitis的木糖还原酶（XR）基因克隆到酿酒酵母后表达效率低，需要优化其表达。
研究策略
通过PCR扩增P. stipitis木糖还原酶基因，系统替换其5'非编码序列（启动子和翻译起始序列）为酿酒酵母ADC1基因的相应元件，并融合酵母木酮糖激酶基因的3'非编码序列，逐步提高XR在酿酒酵母中的表达。
核心内容
为解决酿酒酵母无法高效利用木糖生产乙醇的问题，本研究克隆了Pichia stipitis的木糖还原酶（XR）基因，并系统优化其在酿酒酵母中的表达。通过PCR扩增该基因，将其5'非编码序列逐步替换为酿酒酵母ADC1基因的启动子和翻译起始序列，同时融合酵母木酮糖激酶基因的3'非编码序列。结果显示，原始XR基因表达活性为23×10⁻² U/mg蛋白，仅使用ADC1启动子时升至42×10⁻²，而完全替换为ADC1的5'非编码序列后活性达到192×10⁻²，再添加3'非编码序列后进一步提高至489×10⁻²，总体表达水平提升近21倍。研究表明，Pichia的启动子在酿酒酵母中有效但翻译控制序列效率显著偏低，且3'端序列对表达同样关键。该工作为异源基因表达优化提供了系统策略，显著提高了木糖还原酶产量，对构建高效木糖发酵酿酒酵母菌株具有重要意义。
创新点
1. 首次克隆完整的P. stipitis XR基因并在酿酒酵母中表达；2. 系统比较了不同启动子（TRP5、ADC1）和翻译控制序列对表达的影响；3. 揭示了Pichia XR的5'非编码翻译序列效率低于ADC1序列约5倍；4. 通过完全替换为ADC1的5'非编码序列，使表达提高近10倍；5. 融合酵母XK基因3'非编码序列使表达再提高2倍，总提高近20倍。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | 木糖代谢途径 | xylose reductase (XR) | 木糖还原酶 | 催化 | 来自Pichia stipitis的XR基因，在酿酒酵母中表达，催化木糖还原为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | 木糖代谢途径 | ADC1 promoter (PADC1) | — | 调控 | 酵母醇脱氢酶基因强启动子，用于驱动XR的转录 |
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | — | TRP5 promoter (PTRP5) | — | 调控 | 酵母TRP5启动子，与PADC1比较表达效率 |
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | — | TADC1 (ADC1 5'非编码序列) | — | 调控 | ADC1基因起始密码子邻近的14bp序列，用于增强翻译起始 |
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | — | TXR (Pichia XR 5'非编码序列) | — | 调控 | Pichia XR起始密码子邻近序列，发现其在酿酒酵母中翻译效率较低 |
| Saccharomyces cerevisiae LSK1 | 木酮糖代谢 | xylulokinase (XK) 3'非编码序列 | — | 调控 | 酵母木酮糖激酶基因的3'端非编码序列，用于增强mRNA稳定性和表达 |
关键发现
- P. stipitis CBS5773木糖还原酶NADPH依赖性活性为52.4×10⁻² U/mg蛋白
- 酿酒酵母LSK1/pUCKm8为1.3×10⁻²
- 含原始XR（pLXR1）为23×10⁻²
- 含TRP5启动子（pLXR2）为12×10⁻²
- 含ADC1启动子（pLXR10）为42×10⁻²
- 含ADC1启动子和ADC1翻译序列（pLXR13）为192×10⁻²
- 再加XK 3'非编码序列（pLXR15）为489×10⁻²。从pLXR1到pLXR15表达提高约21倍（近20倍）。Pichia XR的转录信号比TRP5启动子有效，但约为ADC1启动子的一半
- 紧邻起始密码子的序列比ADC1相应序列低约5倍
- 完全替换5'非编码序列后表达提高近10倍
- 加入3'非编码序列再提高2倍。
研究结论
通过将P. stipitis木糖还原酶基因的5'非编码序列完全替换为酿酒酵母ADC1基因的启动子和翻译控制序列，并融合酵母木酮糖激酶基因的3'非编码序列，可使木糖还原酶在酿酒酵母中的表达提高近20倍。这说明Pichia的启动子信号在酿酒酵母中有效，但其翻译控制序列效率低，且3'非编码序列对表达也有重要作用。