Obtaining Mutants for Protoplast Fusion of Gibberellin-Forming Gibberella fujikuroi Strains
- 作者
- K. BERMUDEZ TORRES, B. BRÜCKNER, B. MEIER
- 单位
- Friedrich Schiller University Jena, Institute of Microbiology, Neugasse 24, 0-6900 Jena, Germany
- DOI
- 10.1007/BF02950779
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
产赤霉素的藤仓赤霉菌缺乏原生质体融合所需的遗传标记突变体，且融合后遗传状态和GA3产量影响未知
研究策略
用UV诱变从高产GA3的突变株3422中分离营养缺陷型、抗药性、硝酸盐非利用型和白化型突变体，以PEG为融合剂进行原生质体融合，用樟脑处理促进二倍体形成，用MBC诱导分离，分析融合体的倍性和GA3产量
核心内容
本研究以高产赤霉素（GA3）的藤仓赤霉菌突变株3422为对象，针对该菌缺乏原生质体融合所需遗传标记的问题，采用紫外诱变方法系统分离了营养缺陷型、硝酸盐非利用型（nit）、抗药性及白化型等突变体，并以此为基础，以聚乙二醇为融合剂开展原生质体融合，随后利用樟脑处理促进二倍体化，再经MBC诱导分离并分析融合子的倍性与GA3产量。共获得16个营养缺陷型突变体，其中3个GA3产量不低于亲本，例如G.f. aux65产900 mg/L，为对照的125%；白化突变体A769产量达740 mg/L（103%）。原生质体融合频率介于0.03%至7.5%，最高组合为nit1-187×aux48和nit M-188×cerR-439。经樟脑处理后约5%的快速生长融合菌落为稳定二倍体。关键结果中，二倍体菌株nitM-371×nit1-269/5产GA3达950 mg/L（为最佳亲本119%），nitM-188×aux48/2产910 mg/L（175%），而单倍体分离子产量均未超过二倍体或亲本。研究首次将原生质体融合应用于赤霉素产生菌，证明该策略可有效获得产量显著提升的二倍体融合菌株，但融合子的增产效果具有随机性，仍需通过筛选合适遗传标记组合来优化。
创新点
首次将原生质体融合应用于赤霉素产生菌；采用多种互补标记（硝酸盐同化突变、白化突变等）进行融合；发现白化突变体之间的互补产生橙色菌落可作为可见筛选标记；证明部分二倍体融合菌株GA3产量显著高于亲本
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gibberella fujikuroi | 赤霉素生物合成 | — | — | 催化 | 目标产物GA3合成通路，涉及萜类/二萜生物合成 |
| Gibberella fujikuroi | 硝酸盐同化 | nit1 | 硝酸还原酶 | 催化 | nit1突变体不能利用硝酸盐，对氯酸盐抗性 |
| Gibberella fujikuroi | 硝酸盐同化 | nitM | 硝酸还原酶钼辅因子 | 催化 | nitM突变体影响硝酸还原酶钼辅因子合成 |
| Gibberella fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | — | prephytoene pyrophosphate synthetase / phytoene synthetase | 催化 | 白化突变体阻断类胡萝卜素合成，可与赤霉素途径竞争底物 |
| Gibberella fujikuroi | 萜类/甾醇生物合成 | — | HMG-CoA synthetase | 催化 | cerulenin抑制此酶，用于筛选抗药性突变体 |
关键发现
- 获得16个营养缺陷型突变体，其中3个GA3产量不低于亲本（如G.f. aux65产900 mg/L，为对照125%）
- 获得多个nit突变体，nit1-269产800 mg/L（111%）
- 白化突变体A769产740 mg/L（103%）。原生质体融合频率介于0.03%-7.5%之间，最高为nit1-187×aux48及nit M-188×cerR-439（均7.5%）。经樟脑处理后约5%的快速生长融合菌落为稳定二倍体。二倍体菌株nitM-371×nit1-269/5产GA3 950 mg/L（为最佳亲本的119%）
- nitM-188×aux48/2产910 mg/L（175%）
- nitM-371×nit1-137/1产730 mg/L（140%）。单倍体分离子产量均未超过二倍体或亲本。
研究结论
原生质体融合是改良G. fujikuroi的有效手段，通过合适的遗传标记组合可获得GA3产量显著提高的二倍体融合菌株，但融合子产量具有随机性，需要筛选有利杂交组合。