(-)-Menthol biosynthesis and molecular genetics
- 作者
- Rodney B. Croteau, Edward M. Davis, Kerry L. Ringer, Mark R. Wildung
- 杂志
- Naturwissenschaften（2005）
- DOI
- 10.1007/s00114-005-0055-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析薄荷中(-)-薄荷醇生物合成途径及其分子遗传学基础，并利用基因工程改良薄荷油的产量和组成。
研究策略
通过分离油腺分泌细胞进行前体饲喂和酶学分析，结合EST库和异源表达克隆关键酶基因；利用转基因技术过表达或抑制特定基因以验证功能并改良农艺性状。
核心内容
该研究以薄荷为对象，系统解析了(-)-薄荷醇生物合成途径及其分子遗传学基础。通过分离油腺分泌细胞进行前体饲喂与酶学分析，结合EST库和异源表达克隆关键酶基因，鉴定了八步酶促途径，并揭示其在四个亚细胞区室中的组织分布。研究发现香叶基二磷酸合酶为大/小亚基异源二聚体，柠檬烯合酶产物中94%为(-)-柠檬烯；P450羟化酶的单点突变F363I可将区域选择性从C6转为C3。关键还原酶动力学参数被测定，如异胡椒烯酮还原酶对底物Km为1.0 μM，胡薄荷酮还原酶产生薄荷酮/异薄荷酮比例为55:45。通过过表达DXR使田间薄荷油产量提高40%，反义抑制MFS同时降低薄荷呋喃和胡薄荷酮水平。该研究完整阐明了薄荷醇合成途径，除异构酶外其余酶基因均已克隆，并通过代谢工程实现了薄荷油产量与品质的改良，为培育高产转基因薄荷品种奠定了基础。
创新点
鉴定了薄荷醇合成的八步酶促途径及相应基因；揭示了途径在四个亚细胞区室的组织；通过单氨基酸替换改变P450区域选择性；利用DXS/DXR过表达和MFS反义抑制实现薄荷油产量和品质提升。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成（前体供给） | GPPS large subunit | 香叶基二磷酸合酶大亚基 | 催化 | 与GPPS小亚基形成异源二聚体，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成（前体供给） | GPPS small subunit | 香叶基二磷酸合酶小亚基 | 催化 | 无DDXXD基序，与大亚基共表达才具活性，可调控链长 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | LS | (-)-柠檬烯合酶 | 催化 | 催化GPP环化生成(-)-(4S)-limonene，主要产物94%，副产物约4%蒎烯和2%月桂烯 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | L3OH | 柠檬烯-3-羟化酶 | 催化 | 细胞色素P450，定位于内质网，催化C3羟基化 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | iPD | (-)-反式异胡椒烯醇脱氢酶 | 催化 | NAD依赖，定位于线粒体，催化异胡椒烯醇氧化为异胡椒烯酮 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | iPR | (-)-异胡椒烯酮还原酶 | 催化 | NADPH依赖，胞质，催化异胡椒烯酮还原为(+)-顺式异胡薄荷酮 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | — | (+)-顺式异胡薄荷酮异构酶 | 催化 | 基因未克隆，催化双键异构化生成(+)-胡薄荷酮 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | PR | (+)-胡薄荷酮还原酶 | 催化 | NADPH依赖，胞质，生成(-)-薄荷酮和(+)-异薄荷酮，比例55:45（重组） |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | MR | (-)-薄荷酮还原酶（3R） | 催化 | NADPH依赖，催化薄荷酮还原为(-)-薄荷醇 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成 | MNR | (-)-薄荷酮还原酶（3S，新薄荷醇） | 催化 | 催化薄荷酮还原为(+)-新薄荷醇 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | 薄荷醇生物合成（支路） | MFS | (+)-薄荷呋喃合酶 | 催化 | 细胞色素P450，催化胡薄荷酮羟化形成薄荷呋喃，反义抑制可改善油质 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一步，过表达可提高油产量 |
| 薄荷（Mentha x piperita） | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径第二步，过表达使油产量提高40% |
关键发现
- 薄荷油产量约1%干重，薄荷醇含量约50%；每叶约8000个腺体。GPPS为大/小亚基异源二聚体，kcat约5 s-1；limonene合成酶产物94%为(-)-limonene，另有约4%蒎烯和2%月桂烯；P450羟化酶单点突变F363I可将区域选择性从C6变为C3；异胡椒烯酮还原酶Km为1.0 μM（底物）和2.2 μM（NADPH），kcat
- 3 s-1；胡薄荷酮还原酶Km为2.3 μM（底物）和6.9 μM（NADPH），kcat
- 8 s-1，产生menthone/isomenthone比例55:45（重组）或70:30（天然）；薄荷酮还原酶（3R）Km分别为3.0、41、0.12 μM，kcat
- 6 s-1；过表达DXR使田间薄荷油产量提高40%；反义抑制MFS同时降低menthofuran和pulegone水平。
研究结论
薄荷醇生物合成途径已完全阐明，除异构酶外其余酶基因均已克隆；通过代谢工程改造（DXR过表达和MFS反义）已实现薄荷油产量和品质的改良，有望获得高产的抗病抗除草剂转基因薄荷品种。