Structure, function and biosynthesis of carotenoids in the moderately halophilic bacterium Halobacillus halophilus
- 作者
- Saskia Köcher, Jürgen Breitenbach, Volker Müller, Gerhard Sandmann
- 单位
- Molecular Microbiology and Bioenergetics, Institute of Molecular Biosciences, Goethe University, 60054 Frankfurt/Main, Germany; Biosynthesis Group, Institute of Molecular Biosciences, Goethe University, Biocampus 213, P.O. Box 111932, 60054 Frankfurt/Main, Germany
- 杂志
- Archives of Microbiology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00203-008-0431-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明中度嗜盐菌Halobacillus halophilus中C30类胡萝卜素（staphyloxanthin相关）的结构、生物合成途径、基因组织及其在氧化应激下的保护功能。
研究策略
采用化学抑制剂和随机突变体分析代谢途径中间产物，通过基因组测序和生物信息学鉴定关键基因，利用大肠杆菌功能互补验证基因功能，通过RT-PCR确定基因转录组织，并通过氧化应激实验评价类胡萝卜素的保护作用。
研究路线图
核心内容
该研究以中度嗜盐菌Halobacillus halophilus为对象，系统阐明了其C30类胡萝卜素（与金黄色葡萄球菌staphyloxanthin相关）的结构、生物合成途径及生理功能。通过化学抑制剂处理和随机突变体分析锁定多个代谢中间体，如DPA处理导致积累4,4'-diapophytocene，碱水解得到4,4'-diaponeurosporene-4-oic acid；突变体WH、YC、OC分别积累diapophytocene、diaponeurosporene和diaponeurosporenoic acid。结合基因组测序和生物信息学，鉴定出六个相关基因排列成两个方向相反的操纵子，RT-PCR证实crtNa-crtNc-crtM与crtNb-orfGT-orfAT的转录组织。在大肠杆菌中异源表达证实CrtM为4,4'-diapophytocene synthase，CrtNa为4,4'-diapophytocene desaturase，可将法尼基焦磷酸转化为diapophytocene和diaponeurosporene。氧化应激实验表明，40μM DPA完全抑制有色类胡萝卜素形成，100μM DQ单独使最终光密度降低约一半，两者联合时生长完全停止，失去色素的细胞在氧化胁迫下死亡。该研究证明C30类胡萝卜素作为脂溶性抗氧化剂对嗜盐菌抵抗氧化应激至关重要，为理解其盐依赖性调控奠定了基础。
创新点
首次在H. halophilus中鉴定出与金黄色葡萄球菌staphyloxanthin相关的C30类胡萝卜素途径；发现六个相关基因排列成两个方向相反的操纵子；通过突变体锁定多个中间体；证明C30类胡萝卜素对嗜盐菌抵抗氧化应激至关重要。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | crtM | CrtM | 催化 | 4,4'-diapophytocene synthase，催化两分子法尼基焦磷酸缩合生成4,4'-diapophytocene |
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | crtNa | CrtNa | 催化 | 4,4'-diapophytocene desaturase，催化4,4'-diapophytocene去饱和生成4,4'-diaponeurosporene |
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | crtNc | CrtNc | 催化 | 推测为氧化酶，可能参与4,4'-diaponeurosporene-4-醛的氧化 |
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | crtNb | CrtNb | 催化 | 推测为氧化酶，可能参与4,4'-diaponeurosporene-4-酸的形成 |
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | orf-GT | Orf-GT | 催化 | 糖基转移酶，负责将葡萄糖等糖基连接到4,4'-diaponeurosporene-4-酸上 |
| Halobacillus halophilus DSM 2266 | C30类胡萝卜素生物合成 | orf-AT | Orf-AT | 催化 | 酰基转移酶，负责将脂肪酸酯化到糖基上形成最终产物 |
| Escherichia coli DH5α/JM101 | C30类胡萝卜素生物合成（异源功能互补） | crtM | CrtM | 催化 | 在E. coli中表达后合成4,4'-diapophytocene |
| Escherichia coli DH5α/JM101 | C30类胡萝卜素生物合成（异源功能互补） | crtNa | CrtNa | 催化 | 与crtM共表达后生成4,4'-diaponeurosporene及少量4,4'-diapolycopene |
| Staphylococcus carnosus | staphyloxanthin生物合成 | crtOPQMN | CrtO, CrtP, CrtQ, CrtM, CrtN | 催化 | 携带完整金黄色葡萄球菌类胡萝卜素基因簇，用于制备staphyloxanthin参考标准 |
关键发现
- DPA处理导致H. halophilus积累4,4'-diapophytocene（15-cis和all-trans），碱水解得到4,4'-diaponeurosporene-4-oic acid
- 突变体WH/YC/OC分别积累diapophytocene、diaponeurosporene和diaponeurosporenoic acid。crtM功能验证为4,4'-diapophytocene synthase，crtNa为4,4'-diapophytocene desaturase，二者在大肠杆菌中异源表达可将法尼基焦磷酸转化为diapophytocene和diaponeurosporene。CrtNa与Methylomonas sp. 16a的CrtN同源物具有48%氨基酸一致性（71%相似性），CrtNb与Methylomonas sp. 16a的4,4'-diapolycopenone oxidase有31%一致性（54%相似性），CrtNc与Heliobacillus mobilis的diapophytocene dehydrogenase有55%相似性。转录分析显示crtNa-crtNc-crtM和crtNb-orfGT-orfAT组成两个操纵子（RT-PCR产物分别为928、848、811和765 bp）。氧化应激实验中，40μM DPA完全抑制有色类胡萝卜素形成，100μM DQ单独使最终光密度（OD578）降低约一半，两者联合时生长完全停止
- 在允许氧化应激下50%生长的条件下，失去色素的细胞死亡。
研究结论
H. halophilus通过C30途径合成与staphyloxanthin结构相关的糖基化脂肪酸酯类胡萝卜素，作为脂溶性抗氧化剂对氧化应激下的存活至关重要；其生物合成基因簇包含两个操纵子，crtM和crtNa功能已明确，为深入研究该菌类胡萝卜素保护功能及盐依赖性调控奠定了基础。