Characterisation of oxidative stress-resistant mutants of Streptococcus thermophilus CNRZ368
- 杂志
- Archives of Microbiology（2004）
- DOI
- 10.1007/s00203-004-0712-2
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定 Streptococcus thermophilus CNRZ368 中参与氧化应激防御的基因，并表征其抗性突变体。
研究策略
利用 pGh9:ISS1 随机插入突变构建 2112 个突变体，筛选甲萘醌（menadione）抗性克隆，通过测序鉴定插入位点，分析突变体对空气、甲基紫精和 H2O2 的耐受性，并用实时定量 RT-PCR 检测目标基因在氧化应激下的表达变化。
核心内容
嗜热链球菌CNRZ368的氧化应激防御机制尚不明确。该研究通过pGh9:ISS1随机插入突变构建了2112个突变体，经甲萘醌筛选获得8个抗性克隆（osrA–osrH），对应deoB、gst、rggC、osrD、osrE、osrF、osrG和orfP八个基因座。所有突变体在空气暴露320分钟后存活率至少为野生型的2倍，其中gst、rggC、osrG和orfP突变体对甲基紫精和过氧化氢的抗性均显著增强，而deoB突变体仅对甲基紫精抗性较强。实时定量PCR显示，45分钟过氧化氢处理后，deoB、gst、osrD、osrE和osrF的转录水平较非胁迫条件下降约5倍（相对表达量降至6.4–19.8），orfP下调约2.8倍，而rggC和osrG无显著变化。deoB突变体倍增时间（24.8±2.8分钟）短于野生型（32.9±2.1分钟），且deoB和orfP突变体进入稳定期的OD600（约1.95）显著高于野生型（1.66）。这些结果表明多个基因的失活可赋予氧化应激抗性，且多数相关基因在胁迫下被下调，提示它们可能作为负调控因子或通过代谢调整使细胞进入预适应状态，其中RggC可能参与调控氧化应激防御基因的表达。
创新点
首次将 Rgg 样转录调控因子与氧化应激响应联系起来；鉴定了多个未知功能基因在氧化应激抗性中的作用；揭示了多数氧化应激相关基因在胁迫下下调的现象。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | deoB | DeoB (phosphopentomutase) | 催化 | 编码磷酸戊糖变位酶，参与嘌呤补救途径；突变体对氧化应激抗性增强。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | gst | Gst (proton/sodium-dicarboxylate symporter) | 转运 | 位于ICE St1，属于质子/钠-二羧酸同向转运蛋白家族，可能转运谷氨酸。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | rggC | RggC (Rgg-like transcriptional regulator) | 调控 | 含移码突变，可能通过翻译移码产生全长蛋白；参与调控氧化应激防御基因。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | osrD | OsrD (putative iron-dependent peroxidase) | 催化 | 含TAT信号序列，推测为DyP型铁依赖性过氧化物酶。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | osrE | OsrE (putative kinase) | 催化 | 与Lactococcus lactis pMRC01质粒蛋白有23%同一性，含激酶催化域。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | osrF | OsrF (conserved hypothetical protein) | — | 与Pyrococcus horikoshii PH1052有33%同一性，功能未知。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | osrG | — | — | 无同源基因，S. thermophilus特有。 |
| Streptococcus thermophilus CNRZ368 | 氧化应激防御 | orfP | — | — | 位于ICE St1，无同源基因，即osrH。 |
关键发现
- 从2112个插入突变体中筛选到8个甲萘醌抗性克隆（osrA-osrH），鉴定出8个基因座：deoB、gst、rggC、osrD、osrE、osrF、osrG和orfP。所有突变体在空气暴露320 min后存活率至少比野生型高2倍。gst、rggC、osrG和orfP突变体对甲基紫精和H2O2的抗性显著增强
- deoB突变体对甲基紫精抗性较强但对H2O2抗性较弱
- osrF突变体对H2O2抗性高但对甲基紫精抗性仅轻微增加。实时定量PCR显示，45 min H2O2处理后，deoB、gst、osrD、osrE和osrF的转录水平比非胁迫条件下降约5倍（相对表达量分别降至16.2、19.8、13.8、6.4和13.6，非胁迫为100），orfP降至35.8（约2.8倍下调）
- rggC和osrG无显著变化。deoB突变体倍增时间为24.8±2.8 min，其余突变体接近野生型（32.9±2.1 min）。deoB和orfP突变体进入稳定期的OD600分别为1.94±0.07和1.95±0.06，显著高于野生型1.66±0.11。
研究结论
S. thermophilus CNRZ368 中多个基因的失活可赋予氧化应激抗性，多数相关基因在氧化应激下被下调，提示这些基因可能作为氧化应激防御的负调控因子或通过代谢调整使细胞进入预适应状态。RggC 可能参与调控氧化应激防御基因的表达，该研究为理解乳酸菌的氧化应激防御机制提供了新见解。