Inducible expression of choline sulfate and its regulator BetR in Pseudomonas sp. ATCC19151
- 作者
- Branko Jovcic, Vittorio Venturi, Ljubisa Topisirovic, Milan Kojic
- 杂志
- Archives of Microbiology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00203-011-0685-x
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明 Pseudomonas sp. ATCC19151 中胆碱硫酸酯酶（betC）及其调控因子 BetR 的转录调控机制，并探究该基因簇是否参与渗透压保护。
研究策略
利用 cosmid 文库克隆 bet 基因簇；通过插入突变和遗传互补验证基因功能；构建转录融合测定启动子活性；通过凝胶迁移实验（EMSA）检测 BetR 与启动子区的直接结合。
核心内容
该研究以 Pseudomonas sp. ATCC19151 为对象，克隆并测序了包含 betC、betD、betE 和 betR 的 8,161 bp DNA 片段，系统解析了胆碱硫酸酯利用基因簇的调控机制。通过插入突变证实 ΔbetC 突变体不能以胆碱硫酸酯为唯一碳源生长，而 ΔbetR 突变体在该底物上生长缓慢，遗传互补可恢复表型。启动子活性分析显示 PbetC 和 PbetR 在胆碱硫酸酯存在下被诱导，且不受葡萄糖分解代谢抑制；但在 0.4 至 0.6 M NaCl 浓度下活性无明显变化，表明该通路不参与渗透压保护。凝胶迁移实验证明 LysR 型调控因子 BetR 直接结合 betC-betR 基因间区，且结合能力随胆碱硫酸酯浓度从 1 mM 增至 100 mM 而增强。研究首次揭示 BetR 兼具正调控与负自调控双重功能：胆碱硫酸酯存在时激活 betC 和 betR 转录，缺失时抑制自身表达，该通路可能主要用于提供碳、氮或硫源。
创新点
首次证明 LysR 型调控因子 BetR 直接结合 betC-betR 基因间区，且胆碱硫酸酯作为共诱导剂增强其结合能力；揭示 BetR 的正调控与负自调控双重功能。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas sp. ATCC19151 | 胆碱硫酸酯(COS)利用/降解通路 | betC | BetC (胆碱硫酸酯酶) | 催化 | 将胆碱-O-硫酸酯水解为胆碱和硫酸根；ΔbetC 突变体不能利用 COS 作为唯一碳源 |
| Pseudomonas sp. ATCC19151 | 胆碱硫酸酯(COS)利用/降解通路 | betR | BetR (LysR型转录调控因子) | 调控 | 激活 betC 表达并在无 COS 时负自调控；直接结合 betC-betR 基因间区 |
| Pseudomonas sp. ATCC19151 | 胆碱硫酸酯(COS)转运 | betD | BetD (底物结合ABC转运蛋白) | 转运 | 预测为周质底物结合蛋白，结合 COS |
| Pseudomonas sp. ATCC19151 | 胆碱硫酸酯(COS)转运 | betE | BetE (硫酸盐透性酶) | 转运 | 含有STAS ATP结合域，12个跨膜区，可能参与 COS 跨膜转运 |
关键发现
- 克隆并测序了 8,161 bp 的 KpnI-NotI 片段，包含 betC、betD、betE 和 betR 基因
- 与 Pseudomonas mendocina ymp 同源性：betC 85%、betR 77%、betD 83%、betE 77%
- ΔbetC 突变体不能以胆碱硫酸酯（COS）为唯一碳源生长，互补后恢复
- ΔbetR 突变体在 COS 上生长缓慢
- PbetC 和 PbetR 在 COS 存在下诱导活性，且葡萄糖不产生分解代谢抑制
- 在 0.4、0.5、0.6 M NaCl 下启动子活性无显著变化
- EMSA 显示 BetR 直接结合 intergenic 区域，且结合量随 COS 浓度（1-100 mM）增加而增加。
研究结论
在 Pseudomonas sp. ATCC19151 中，COS 利用基因簇由 BetR 调控：COS 存在时 BetR 激活 betC 和 betR 的转录，COS 缺失时 BetR 抑制自身转录；该通路不参与渗透压保护，可能用于提供碳、氮或硫源。