Fermentation performance and intracellular metabolite patterns in laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- J. Zaldivar, A. Borges, B. Johansson, H.P. Smits, S.G. Villas-Boas, J. Nielsen, L. Olsson
- 单位
- 丹麦技术大学生物过程中心
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2002）
- DOI
- 10.1007/s00253-002-1056-y
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
工业酿酒酵母无法利用木糖，需要将木糖代谢途径引入工业菌株，以利用木质纤维素原料中的戊糖生产燃料乙醇，并比较实验室与工业背景菌株的发酵性能和胞内代谢物差异。
研究策略
将来自树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的XYL1和XYL2基因以及酿酒酵母内源XKS1基因导入工业菌株A，构建木糖利用重组菌株A4和A6；在厌氧批培养中以50 g/L葡萄糖和50 g/L木糖的混合碳源评估各菌株的发酵性能，并利用高效阴离子交换色谱分析磷酸戊糖途径和糖酵解途径的关键胞内代谢物。
核心内容
该研究将树干毕赤酵母的木糖还原酶（XYL1）和木糖醇脱氢酶（XYL2）基因以及酿酒酵母内源木酮糖激酶（XKS1）基因导入工业多倍体酿酒酵母菌株A，构建了重组菌株A4和A6，并在含50 g/L葡萄糖和50 g/L木糖的混合碳源厌氧批培养中，与实验室背景菌株TMB 3001系统比较发酵性能及胞内代谢物。结果显示，工业重组菌株的木糖比消耗速率分别达0.21和0.14 g/g/h，较TMB 3001的0.06 g/g/h提高2.4至3.5倍，最终乙醇浓度均为25.2 g/L，高于对照菌株；但木糖醇副产物严重积累，约30%消耗木糖转化为木糖醇，峰值达13.6至15.9 g/L。胞内代谢物分析表明，木糖消耗阶段工业菌株的磷酸戊糖途径中间物水平更高，而糖酵解中间物果糖-1,6-二磷酸在木糖阶段较葡萄糖阶段降低65倍。该工作证明工业菌株背景更利于木糖利用和乙醇生产，但辅因子不平衡导致的木糖醇积累仍是制约产率的关键瓶颈，需进一步优化代谢通量。
创新点
将木糖利用途径整合到工业多倍体酿酒酵母菌株中，并与实验室菌株进行系统比较；同时测定胞内磷酸戊糖途径和糖酵解中间代谢物，揭示菌株背景、基因型和碳源对代谢物水平的影响。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母工业菌株A（重组菌株A4/A6） | 木糖利用途径 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 来源于Pichia stipitis，催化木糖还原为木糖醇 |
| 酿酒酵母工业菌株A（重组菌株A4/A6） | 木糖利用途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 来源于Pichia stipitis，催化木糖醇氧化为木酮糖 |
| 酿酒酵母工业菌株A（重组菌株A4/A6） | 木糖利用途径 | XKS1 | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 酿酒酵母内源基因，催化木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖 |
| 酿酒酵母工业菌株A（重组菌株A4/A6） | 基因表达调控 | PGK1p | — | 调控 | PGK1启动子用于驱动XYL1、XYL2和XKS1的表达 |
| 酿酒酵母（各测试菌株） | 糖转运 | — | 己糖转运蛋白（hexose transporter） | 转运 | 酿酒酵母缺乏特异性木糖转运蛋白，木糖通过己糖转运蛋白摄取，亲和力低（98-170 mM） |
| 酿酒酵母实验室菌株CEN.PK113-7A（TMB 3001） | 木糖利用途径 | XYL1, XYL2, XKS1 | XR, XDH, XK | 催化 | 实验室背景的木糖利用参考菌株 |
关键发现
- 构建的工业重组菌株A4和A6最大比生长速率分别为0.27和0.30 h^-1，亲本A为0.32 h^-1，实验室菌株TMB 3001为0.26 h^-1
- 比乙醇产率分别为0.04、0.03、0.13和0.04 g/g/h。木糖比消耗速率A4为0.21 g/g/h、A6为0.14 g/g/h，分别比TMB 3001（0.06 g/g/h）高3.5倍和2.4倍。最终乙醇浓度A4和A6均为25.2 g/L，高于TMB 3001的23.3 g/L和亲本A的20.8 g/L。木糖醇峰值A4为13.6 g/L、A6为15.9 g/L，而TMB 3001为4.1 g/L
- 木糖醇/木糖产率A4为0.27 g/g、A6为0.31 g/g，TMB 3001为0.16 g/g，约30%的消耗木糖转化为木糖醇。葡萄糖在36 h耗尽，葡萄糖比消耗速率为2.7-2.9 g/g/h。木糖消耗阶段，工业重组菌株的PPP中间代谢物水平高于实验室菌株
- 菌株A的果糖-1,6-二磷酸在木糖阶段比葡萄糖阶段低65倍。
研究结论
将木糖利用途径导入工业酿酒酵母菌株A可以获得能够利用木糖的重组菌株，且工业背景菌株的木糖消耗速率、生物量和乙醇产量优于实验室背景菌株，但存在木糖醇副产物积累高的问题，需要进一步优化辅因子平衡和代谢通量以实现高效乙醇生产。