Comparative direct infusion ion mobility mass spectrometry profiling of Thermus thermophilus wild-type and mutant \(\Delta \mathrm{crU}C\) carotenoid extracts
- 作者
- Timo D. Stark, Angel Angelov, Mathias Hofmann, Wolfgang Liebl, Thomas Hofmann
- 单位
- Food Chemistry and Molecular Sensory Science, Technische Universitat Munchen; Microbiology, Technische Universitat Munchen; Waters
- 杂志
- Analytical and Bioanalytical Chemistry（2013）
- DOI
- 10.1007/s00216-013-7426-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定Thermus thermophilus HB27中ORF TT_P0062（cruC）是否编码催化玉米黄质（zeaxanthin）糖基化的糖基转移酶，该酶是thermozeaxanthin生物合成最后修饰步骤所必需的。
研究策略
通过同源重组构建cruC基因敲除突变体（卡那霉素标记菌株ΔcruC:kat和无标记菌株ΔcruC），采用直接进样结合电喷雾电离-离子迁移-飞行时间质谱（ESI-IM-TOFMS）比较野生型和突变体的类胡萝卜素谱图。
研究路线图
核心内容
本研究以嗜热菌Thermus thermophilus HB27为对象，通过同源重组构建cruC（TT_P0062）基因敲除突变体（含卡那霉素标记的ΔcruC:kat及无标记ΔcruC），并采用直接进样电喷雾电离-离子迁移-飞行时间质谱（ESI-IM-TOFMS）比较野生型与突变体的类胡萝卜素粗提物谱图。结果显示，ΔcruC:kat突变体中thermozeaxanthins的基峰信号强度（钾加合物m/z 965.6279）较野生型降低58倍，同时大量积累玉米黄质而几乎不产生thermozeaxanthins，并伴有少量β-隐黄质积累。野生型以thermozeaxanthins Z1-11至Z1-17为主要产物，钠加合物m/z 949.6511信号最强；两类化合物的离子迁移漂移时间分别为4.07-4.14 ms和6.65-7.03 ms，突变体UV-Vis光谱较野生型蓝移2 nm。上述结果首次从实验上证明cruC编码的糖基转移酶是玉米黄质糖基化所必需，其缺失阻断thermozeaxanthin生物合成终末步骤并导致底物积累。同时，直接进样ESI-IM-TOFMS方法无需繁琐色谱分离即可快速灵敏解析细菌类胡萝卜素谱图，具备高通量分析其他萜类及脂肪酸衍生物的潜力。
创新点
首次从实验上证明ORF TT_P0062编码玉米黄质糖基化所需的糖基转移酶；开发了一种直接进样、快速高效的ESI-IM-TOFMS方法，可直接分析粗丙酮提取物中的类胡萝卜素，具有高灵敏度和高通量潜力。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermus thermophilus HB27 | 类胡萝卜素生物合成途径（thermozeaxanthin合成） | cruC (TT_P0062) | 糖基转移酶（glycosyltransferase-like family 2） | 催化 | 催化玉米黄质（zeaxanthin）的糖基化反应，生成thermozeaxanthins；敲除后突变体积累玉米黄质，thermozeaxanthins产量大幅下降。 |
关键发现
- 在ΔcruC:kat突变体中，thermozeaxanthins的基峰信号强度（钾加合物m/z
- 6279）较野生型降低58倍；突变体大量积累玉米黄质（zeaxanthin）而几乎不产生thermozeaxanthins，同时伴有少量β-隐黄质；野生型中thermozeaxanthins Z1-11至Z1-17为主要产物，其钠加合物m/z
- 6511（[C59H90O8Na]+）为最强信号；类胡萝卜素1-3的漂移时间为4.07-4.14 ms，thermozeaxanthins为6.65-7.03 ms；突变体UV-Vis吸收光谱较野生型有2 nm的蓝移。
研究结论
cruC（TT_P0062）编码的糖基转移酶是玉米黄质糖基化所必需的，该基因缺失导致thermozeaxanthins生物合成受阻并积累玉米黄质。直接进样ESI-IM-TOFMS方法可快速、灵敏地分析细菌类胡萝卜素谱图，适用于其他萜类及脂肪酸衍生物的高通量分析。