Biotransformation of limonene by bacteria, fungi, yeasts, and plants
- 作者
- W. A. Duetz, H. Bouwmeester, J. B. van Beilen, B. Witholt
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2003）
- DOI
- 10.1007/s00253-003-1221-y
- 所属领域
- 发酵工程
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
柠檬烯的区域选择性氧化生物转化，以获得高价值的含氧单萜衍生物（如香芹酮、薄荷醇、紫苏醇等），并解决化学氧化区域选择性差的问题。
研究策略
综述细菌、真菌、酵母和植物中柠檬烯生物转化研究，重点分析区域选择性生物催化剂的发现、植物P450酶的特性及基因克隆、异源表达和蛋白工程改造。
研究路线图
核心内容
柠檬烯的区域选择性氧化是获取高价值含氧单萜衍生物的关键途径，而化学氧化法区域选择性差，因此生物转化成为研究热点。该综述系统总结了细菌、真菌、酵母及植物中柠檬烯生物转化的最新进展，重点分析了不同来源的区域特异性生物催化剂。研究发现，Rhodococcus opacus PWD4利用甲苯双加氧酶将D-柠檬烯转化为trans-carveol，比活达15 U/g干重且无区域异构体；Cladosporium sp. T7在4天内可积累trans-limonene-1,2-diol达1.5 g/L。植物来源的P450柠檬烯羟化酶已被克隆并在异源宿主中功能表达，其中薄荷C6/C3羟化酶对天然对映体产生超过95%的trans-异构体，而单氨基酸替换F363I即可将C6羟化酶转变为C3羟化酶，展现出蛋白工程改造的潜力。尽管目前仍面临寻找选择性水合酶等挑战，但随着酶在食品级宿主中高表达的实现，大规模D-柠檬烯生物转化工艺有望在未来十年内成为现实。
创新点
总结了过去5年发现的3位、6位、7位区域特异性微生物催化剂；报道了植物P450柠檬烯羟化酶的克隆与功能表达；通过单氨基酸替换（F363I）改变了酶的区域特异性。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida GS1 | 柠檬烯降解（cymene途径） | — | cymene monooxygenase、两个脱氢酶 | 催化 | 将D-柠檬烯转化为(+)-perillic acid，比活约10 U/g干重。 |
| Escherichia coli (重组菌，携带Bacillus stearothermophilus BR388基因片段) | 柠檬烯降解 | limonene hydroxylase (3.6 kb subfragment) | 柠檬烯羟化酶 | 催化 | 产生perillyl alcohol和carvone，比例3:1。 |
| Bacillus stearothermophilus BR388 | 柠檬烯降解 | — | 柠檬烯羟化酶（另外还有形成α-松油醇的酶） | 催化 | 将D-柠檬烯转化为perillyl alcohol、α-松油醇和perillaaldehyde。 |
| Rhodococcus erythropolis DCL14 | 柠檬烯降解（1,2-环氧化途径） | — | 环氧化物水解酶、Baeyer-Villiger单加氧酶 | 催化 | 起始于1,2-环氧化，经水解和Baeyer-Villiger氧化降解。 |
| Xanthobacter sp. C20 | 环己烷降解途径 | — | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 将D-柠檬烯转化为(4R,8R)-8,9-环氧化物，L-柠檬烯产生78:22的异构体混合物。 |
| Rhodococcus opacus PWD4 | 甲苯降解途径 | — | 甲苯双加氧酶 | 催化 | 将D-柠檬烯转化为(+)-trans-香芹醇，比活15 U/g干重，区域选择性完全。 |
| Rhodococcus globerulus PWD8 | 未知 | — | 脱氢酶 | 催化 | 将香芹醇氧化为香芹酮。 |
| Penicillium digitatum NRRL 1202 | 柠檬烯转化 | — | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 通过8,9-环氧化产生α-松油醇，比活低于0.1 U/g干重。 |
| Cladosporium sp. T7 | 柠檬烯转化 | — | 未明确 | 催化 | 产生trans-柠檬烯-1,2-二醇1.5 g/l和cis-二醇0.2 g/l（4天发酵）。 |
| Hormonema sp. UOFS Y-0067 | 柠檬烯转化 | — | 未明确（推测P450） | 催化 | 专一性3位羟基化产生异胡薄荷醇，比活1-2 U/g干重（本实验室）。 |
| Pleurotus sapidus | 柠檬烯转化 | — | 未明确 | 催化 | 产生cis-/trans-香芹醇，并部分氧化为香芹酮。 |
| Mentha spicata (留兰香) | 单萜生物合成 | (-)-limonene-6-hydroxylase | 细胞色素P450 (CYP71) | 催化 | 催化(-)-柠檬烯6位羟基化产生香芹醇，产物>95% trans-异构体。 |
| Mentha piperita (薄荷) | 单萜生物合成 | (-)-limonene-3-hydroxylase | 细胞色素P450 (CYP71) | 催化 | 催化3位羟基化产生异胡薄荷醇。 |
| Perilla frutescens (紫苏) | 单萜生物合成 | (-)-limonene-7-hydroxylase | 细胞色素P450 | 催化 | 催化7位羟基化产生紫苏醇。 |
| Carum carvi (葛缕子) | 单萜生物合成 | (+)-limonene-6-hydroxylase | 细胞色素P450 | 催化 | 催化(+)-柠檬烯6位羟基化产生>95% trans-香芹醇。 |
| Saccharomyces cerevisiae (异源表达宿主) | 异源表达薄荷P450 | 薄荷柠檬烯羟化酶cDNA | 细胞色素P450 | 催化 | 功能表达留兰香和薄荷的P450羟化酶。 |
关键发现
- Rhodococcus opacus PWD4利用甲苯双加氧酶将D-柠檬烯转化为trans-carveol，比活高达15 U/g干重，且无区域异构体
- Pseudomonas putida GS1在过量D-柠檬烯存在下产生(+)-perillic acid，比活约10 U/g干重
- Bacillus stearothermophilus BR388的3.6 kb limonene hydroxylase在E. coli中产生perillyl alcohol与carvone（3:1）
- Xanthobacter sp. C20将D-柠檬烯转化为(4R,8R)-柠檬烯-8,9-环氧化物，L-柠檬烯产生78:22的(4S,8R)/(4S,8S)混合物
- Cladosporium sp. T7在4天内产生trans-limonene-1,2-diol 1.5 g/l和cis-0.2 g/l
- 70L反应器在96h内从D-柠檬烯生产900g (1S,2S)-trans-二醇
- 薄荷C6/C3羟化酶对天然对映体产生>95% trans-异构体，对其他对映体以10-25%速率接受
- 单氨基酸替换F363I将C6羟化酶转变为C3羟化酶
- Penicillium digitatum NRRL 1202产生α-松油醇的比活低于0.1 U/g干重
- Hormonema sp. UOFS Y-0067专一性3位羟基化产生异胡薄荷醇（本实验室测定比活1-2 U/g干重）。
研究结论
过去5年柠檬烯生物转化在区域选择性方面取得显著进展，但仍有挑战，如寻找选择性水合酶。若能实现酶在食品级宿主中的高表达，工业过程可行，预计未来十年内将出现大规模D-柠檬烯生物转化工艺。