Bioelectrochemical probing of intracellular redox processes in living yeast cells—application of redox polymer wiring in a microfluidic environment
- 作者
- Arto Heiskanen, Vasile Coman, Natalie Kostesha, David Sabourin, Nick Haslett, Keith Baronian, Lo Gorton, Martin Dufva, Jenny Emnéus
- 单位
- Department of Micro- and Nanotechnology, Technical University of Denmark; School of Biological Sciences, University of Canterbury; Department of Biochemistry and Structural Biology, Lund University; Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, Babes-Bolyai University; Agriculture and Life Sciences Division, Lincoln University
- 杂志
- Analytical and Bioanalytical Chemistry（2013）
- DOI
- 10.1007/s00216-013-6709-4
- 所属领域
- 微生物生物电化学/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在微流体环境中对活酵母细胞内氧化还原过程进行生物电化学探测时，非贴壁酵母细胞难以固定在电极上，且传统可溶性介体在微流控中因被冲出而信号弱，需要开发有效的细胞固定和电子传递新方法。
研究策略
构建集成微电极阵列的微流控平台，采用奥萨米氧化还原聚合物（PVI-Os）与亲脂性介体甲萘醌组成新型双介体系统，结合PEI预修饰细胞，通过反向泵送实现细胞在电极上的3D网络固定和电子“布线”，从而自动化监测代谢响应。
研究路线图
核心内容
该研究构建了集成微电极阵列的微流控平台，用于活体酿酒酵母细胞内氧化还原过程的生物电化学探测。针对非贴壁酵母难以固定及可溶性介体易被冲出等问题，提出甲萘醌与锇氧化还原聚合物（PVI-Os）构成的新型双介体系统，并结合PEI预修饰、反向泵送实现细胞三维网络固定与电子“布线”。该系统无需透析膜即可将电子从细胞内代谢反应传递至电极，实现自动化动态监测。结果显示，野生型ENY.WA菌株对葡萄糖和果糖的稳态电流分别为71±2 nA和70±2 nA，无显著差异；而PGI缺失突变株EBY44对葡萄糖响应（128±4 nA）约为果糖（54±3 nA）的2.4倍，成功区分的代谢差异，而传统六氰合铁酸盐-甲萘醌体系电流仅约14 nA。每电极平均固定约2900个细胞，RSD为2.6%。该平台可自动化监测代谢动态并区分不同糖源利用，适用于遗传修饰筛选和多种细胞功能分析。
创新点
首次提出甲萘醌-PVI-Os双介体系统应用于微流控酵母生物电化学；PVI-Os既作为电子传递介体又作为3D固定基质，无需透析膜即可固定非贴壁细胞；集成微流控主板与可替换芯片实现自动化高通量遗传修饰筛选。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae ENY.WA-1A | 糖酵解途径（GP）/戊糖磷酸途径（PPP） | PGI1 | 磷酸葡萄糖异构酶（phosphoglucose isomerase） | 催化 | 野生型菌株，PGI1表达正常，葡萄糖和果糖在GP和PPP间非偏好分配 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY44 | 糖酵解途径（GP）/戊糖磷酸途径（PPP） | PGI1（缺失：pgi1-1Δ::URA3） | 磷酸葡萄糖异构酶（缺失） | 调控 | ENY.WA-1A的PGI1缺失突变株，导致葡萄糖主要流入PPP生成NADPH，果糖主要流入GP生成NADH |
| Saccharomyces cerevisiae | 线粒体呼吸链/甲萘醌还原相关酶 | — | 甲萘醌还原酶（包括线粒体复合物） | 催化 | 甲萘醌在细胞内被还原为甲萘二酚，NADH/NADPH为其辅因子 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞膜电子传递 | — | PVI-Os（锇氧化还原聚合物） | 转运 | 作为次级介体，氧化甲萘二酚并向电极传递电子，同时形成3D网络固定细胞 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞膜电子传递 | — | 甲萘醌（menadione） | 转运 | 亲脂性初级介体，可透过质膜在胞内/胞外间穿梭电子 |
关键发现
- ENY.WA菌株对葡萄糖和果糖的稳态电流分别为71±2 nA和70±2 nA（t检验p=0.653，无显著差异）
- EBY44菌株对葡萄糖的电流为128±4 nA，是果糖响应（54±3 nA）的2.4倍
- 每工作电极平均细胞数约2900个，RSD为2.6%
- 微流控中传统的六氰合铁酸盐(Ⅲ)-甲萘醌体系稳态电流仅约14 nA，而新体系显著提升
- PVI-Os电沉积浓度需10 mg/ml（1 mg/ml时响应低于20 nA）
- 微流控泵容量为650±8 nL/转。
研究结论
开发的微流控平台结合甲萘醌-PVI-Os双介体系统，可自动化监测酿酒酵母的氧化还原代谢动态，有效区分野生型与PGI缺失突变株对不同糖源的代谢差异，适用于遗传修饰筛选及多种细胞功能分析，并可通过改变芯片设计进一步并行化。