Dissolved-oxygen-stat controlling two variables for methanol induction of rGuamerin in Pichia pastoris and its application to repeated fed-batch
- 作者
- H.-K. Lim, S.-J. Choi, K.-Y. Kim, K.-H. Jung
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2003）
- DOI
- 10.1007/s00253-003-1307-6
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中利用甲醇诱导表达rGuamerin时，溶解氧（DO）与甲醇流加速率（MFR）相互关联，传统独立控制方式难以同步优化，导致产量受限且长期生产不稳定
研究策略
提出双变量DO-stat控制策略，同时控制进气流中纯氧分压比（O₂ᴾᴿ）和甲醇流加速率（MFR），实现甲醇诱导的自动控制；并应用重复补料分批培养，周期性地补加盐类以延长生产
核心内容
该研究针对毕赤酵母甲醇诱导表达rGuamerin过程中溶解氧与甲醇流加速率相互关联、传统独立控制难以同步优化的问题，提出了一种双变量DO-stat控制策略。该方法将进气中纯氧分压比与甲醇流加速率联动控制，同时操纵氧气传递速率和氧气摄取速率，将溶解氧维持在设定窗口内，避免了甲醇积累毒性和氧限制。采用该策略后，细胞浓度超过140 g/L，rGuamerin表达水平达450 IU/L，较传统手动控制提高40%；诱导阶段比生产率为0.13 IU g⁻¹ h⁻¹，为传统系统0.06 IU g⁻¹ h⁻¹的两倍。进一步将方法应用于重复补料分批培养，周期补加盐类以维持长期稳定，培养超过250 h，平均表达量约430 IU/L（约473 mg/L），累计产量约4761 IU（5.2 g），可持续十个循环以上，虽表达量逐渐从590降至330 IU/L但未见急剧下降。该策略有效实现了甲醇诱导与溶解氧的同步自动控制，显著提高了目标蛋白产量和比生产率，并可推广至其他甲基营养酵母的生产体系。
创新点
将O₂ᴾᴿ与MFR联动控制，同时操纵氧气传递速率（OTR）和氧气摄取速率（OUR）维持DO在设定窗口；自动控制可避免甲醇积累毒性和氧限制；重复补料分批通过补加盐类维持长期稳定生产
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 (his4, Mut⁺) | 甲醇诱导/异源蛋白表达 | AOX1 | — | 调控 | 甲醇诱导型启动子，驱动rGuamerin表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 异源蛋白表达 | Guamerin | rGuamerin | 调控 | 目标产物，弹性蛋白酶抑制剂，融合α-factor信号肽分泌至培养基 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌通路 | α-factor leader | α-mating factor | 转运 | 引导rGuamerin分泌到胞外培养基 |
关键发现
- 采用双变量DO-stat控制，细胞浓度超过140 g/l，rGuamerin表达水平达到450 IU/l，比传统手动控制甲醇流加的培养高40%
- 诱导阶段比生产率为0.13 IU g⁻¹ h⁻¹，为传统系统（0.06 IU g⁻¹ h⁻¹）的两倍
- 甲醇流加速率自动升至20.3 g/h。重复补料分批培养超过250 h，rGuamerin平均表达量约430 IU/l（相当于473 mg/l），累计产量约4761 IU（5.2 g）
- 补加盐类后可持续十个循环以上，虽有逐渐下降（从590降至330 IU/l），但未出现急剧降低
研究结论
所提出的双变量DO-stat控制策略能有效同步控制甲醇诱导与溶解氧水平，显著提高rGuamerin表达量和比生产率，并通过重复补料分批培养实现长期稳定生产，可推广至其他甲基营养酵母生产治疗性蛋白