Investigation of factors influencing production of the monocyclic carotenoid torulene in metabolically engineered Escherichia coli
- 作者
- Pyung Cheon Lee, Benjamin N. Mijts, Claudia Schmidt-Dannert
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1007/s00253-004-1619-1
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
研究重组大肠杆菌中影响单环类胡萝卜素torulene生产的关键因素，包括酶表达水平、培养条件和异戊二烯前体途径的改造。
研究策略
通过调节番茄红素环化酶突变体crtY2的基因剂量、优化培养温度、pH、碳源和培养基组成，并组合过表达异戊二烯途径关键基因（dxs、dxr、idi、ispA），在摇瓶和生物反应器中评估torulene产量。
研究路线图
核心内容
该研究系统考察了代谢工程大肠杆菌JM109中影响单环类胡萝卜素torulene生产的关键因素，包括酶表达水平、培养条件和异戊二烯前体途径改造。作者通过调节突变型番茄红素环化酶crtY2的基因剂量，优化温度、pH和碳源，并组合过表达MEP途径关键基因dxs、dxr、idi和ispA，在摇瓶和生物反应器中评估了torulene产量。结果显示，高拷贝crtY2使torulene产量提高至330 μg/g-DCW，但伴随β-胡萝卜素副产物增加；28°C较37°C产量提升约2.5倍；以甘油为碳源时产量达280–300 μg/g-DCW，而葡萄糖仅17–23 μg/g-DCW，抑制约14倍；组合过表达idi和ispA可使产量提高达3.1–3.3倍。生物反应器好氧条件下，TB培养基体积产量达1431 μg/L，比微好氧条件高2–4倍。最终torulene产量较初始工艺提高约3倍，但仍低于同条件下的β-胡萝卜素或番茄红素产量。该研究为大肠杆菌中类胡萝卜素及其衍生物的发酵优化提供了重要参考，明确了碳源选择、温度控制和前体供应对单环类胡萝卜素生产的关键影响。
创新点
首次在生物反应器中研究重组大肠杆菌类胡萝卜素生产；系统考察了crtY2基因剂量和多种碳源的影响；发现组合过表达idi和ispA可显著提高torulene产量达3倍以上。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPP synthase） | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶（phytoene synthase） | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase） | 催化 | 野生型，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtI14 | 突变型八氢番茄红素脱氢酶（evolved phytoene desaturase） | 催化 | 体外进化突变体，催化生成四脱氢番茄红素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶（lycopene β-cyclase） | 催化 | 野生型，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素合成途径 | crtY2 | 突变型番茄红素β-环化酶（evolved lycopene β-cyclase） | 催化 | 体外进化突变体，催化番茄红素单环化生成torulene |
| Escherichia coli JM109 | 异戊二烯前体途径（MEP途径） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXP synthase） | 催化 | 催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP |
| Escherichia coli JM109 | 异戊二烯前体途径（MEP途径） | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶（DXP reductase） | 催化 | 催化DXP还原生成MEP |
| Escherichia coli JM109 | 异戊二烯前体途径（MEP途径） | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶（IPP isomerase） | 催化 | 催化IPP与DMAPP相互转化 |
| Escherichia coli JM109 | 异戊二烯前体途径（MEP途径） | ispA | 法尼基焦磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
关键发现
- 高拷贝crtY2使番茄红素完全转化，torulene产量提高至330±19 μg/g-DCW（1.4倍），但β-胡萝卜素副产物增加至132±6 μg/g-DCW（2.8倍），总类胡萝卜素降低20%
- 培养温度28°C较37°C提高约2.5倍
- 甘油作碳源时torulene产量为280-300 μg/g-DCW，葡萄糖仅17-23 μg/g-DCW（抑制约14倍）
- 在LB、2×YT、TB中甘油分别达到285、310、343 μg/g-DCW
- 葡萄糖对番茄红素、四脱氢番茄红素和β-胡萝卜素生产也有约68倍抑制
- 过表达dxs、dxr、idi和/或ispA的组合使torulene产量提高达3.1-3.3倍，最佳组合为pBBR-idi+pUC-ispA等
- 生物反应器好氧条件下体积产量：MR培养基1240 μg/L，TB培养基1431 μg/L，分别比微好氧（245和500 μg/L）高2-4倍
- 好氧条件下番茄红素高效转化为torulene。
研究结论
通过优化crtY2基因剂量、培养条件（28°C、甘油碳源）和异戊二烯前体途径的代谢工程，torulene产量比初始工艺提高3倍，但比相同条件下的β-胡萝卜素或番茄红素产量低1.5倍以上；该研究为大肠杆菌中类胡萝卜素及其衍生物的发酵优化提供了重要参考。