Construction of a self-cloning sake yeast that overexpresses alcohol acetyltransferase gene by a two-step gene replacement protocol
- 作者
- I. Hirosawa, K. Aritomi, H. Hoshida, S. Kashiwagi, Y. Nishizawa, R. Akada
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1007/s00253-004-1563-0
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
构建不含外源DNA的自克隆清酒酵母，通过过表达酒精乙酰转移酶基因ATF1提高清酒中乙酸异戊酯含量，并规避消费者对转基因生物的担忧。
研究策略
利用两步基因替换法，将酵母自身的组成型TDH3启动子插入ATF1基因上游，使用携带显性药物抗性标记和反选择标记的pGG119载体，通过同源重组在清酒酵母Kyokai No.7中实现无外源DNA的启动子整合。
核心内容
本研究构建了一种不含外源DNA的自克隆清酒酵母，通过两步基因替换法将酵母自身的组成型TDH3启动子插入ATF1基因上游，实现酒精乙酰转移酶的过表达。利用携带显性药物抗性标记和GALp-GIN11M86反选择标记的pGG119载体，在工业多倍体清酒酵母Kyokai No.7中完成同源重组和标记切除，最终菌株仅含酵母自身DNA，无任何细菌载体或抗性基因残留。所得自克隆菌株RAK1857的乙酸异戊酯产量达24.2 ppm，约为野生型（4.9 ppm）的4.9倍，整合型菌株RAK1809为15.4 ppm，约为野生型的3.1倍；三株菌的酒精含量均为15.5%，发酵周期27至28天，产酸水平无显著差异。Southern blot和PCR分析确认自克隆菌株中不含pBluescript等细菌载体序列，仅有0.7 kb的TDH3启动子插入。该工作首次在工业多倍体酵母中实现无外源标记的启动子整合，显著提升清酒风味物质产量，为规避消费者对转基因生物担忧的商业酿造应用提供了可行的技术路线。
创新点
首次构建了表达受控的自克隆工业酵母；采用显性反选择系统（GALp-GIN11M86）在工业多倍体酵母中实现DNA序列的完全切除；最终菌株只含酵母自身DNA，无任何细菌载体或抗性基因残留。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 清酒酵母 Kyokai No.7 | 乙酸异戊酯合成途径 | ATF1 | 乙醇乙酰转移酶 | 催化 | 过表达ATF1以提高乙酸异戊酯产量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 清酒酵母 Kyokai No.7 | 糖酵解途径 | TDH3 | — | 调控 | 使用TDH3组成型启动子驱动ATF1过表达 |
关键发现
- 构建的自克隆菌株RAK1857乙酸异戊酯产量为24.2 ppm，是野生型Kyokai No.7（4.9 ppm）的约4.9倍
- 整合型菌株RAK1809为15.4 ppm，约为野生型的3.1倍。乙酸产量方面，野生型为0.24 g/l，整合型为0.18 g/l，自克隆菌株为0.19 g/l。三株菌的酒精含量均为15.5%，发酵天数27~28天。Southern blot和PCR分析确认自克隆菌株中不含pBluescript等细菌载体序列，仅含0.7 kb的TDH3启动子插入。
研究结论
成功构建了首个自克隆的ATF1过表达清酒酵母，该菌株仅含酵母自身DNA，无外源标记和载体序列，显著提高乙酸异戊酯产量，有望直接应用于清酒商业酿造。