Metabolic engineering for synthesis of aryl carotenoids in Rhodococcus
- 作者
- Luan Tao, L. Winona Wagner, Pierre E. Rouvière, Qiong Cheng
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1007/s00253-005-0064-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在Rhodococcus erythropolis中异源表达来自Brevibacterium linens的β-胡萝卜素脱氢酶基因crtU，以合成不对称芳基类胡萝卜素chlorobactene，并优化表达策略与发酵条件。
研究策略
比较两种质粒表达系统（pDCQ140与pDCQ143）；利用氯霉素抗性基因启动子驱动crtU共转录；敲除竞争性β-胡萝卜素酮化酶基因crtO以减少副产物；优化培养基并在10 L发酵罐进行补料分批发酵。
核心内容
该研究在红平红球菌中异源表达来源于短杆菌的β-胡萝卜素脱氢酶基因crtU，以合成不对称芳基类胡萝卜素chlorobactene。研究者比较了两种质粒表达系统，发现pDCQ143利用氯霉素抗性基因启动子驱动crtU共转录，可实现超过90%的γ-胡萝卜素向chlorobactene转化，而pDCQ140仅7%。通过敲除竞争性β-胡萝卜素酮化酶基因crtO，chlorobactene成为主要类胡萝卜素（>90%），有效减少了副产物4-酮基-γ-胡萝卜素的积累。在10升发酵罐中进行补料分批发酵，获得370克湿细胞，最终产chlorobactene约18毫克（约200 ppm），且为几乎唯一的类胡萝卜素。结果表明，通过宿主工程和发酵优化，红平红球菌可作为高效合成芳基类胡萝卜素的有效平台，该策略为在其他微生物中生产复杂类胡萝卜素提供了参考。
创新点
首次在Rhodococcus中实现chlorobactene的异源合成；利用Cm^r基因启动子实现高效共转录表达；通过敲除crtO获得高纯度chlorobactene；建立10 L规模发酵工艺。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 (CrtO敲除突变体) | 类胡萝卜素合成途径 | crtU | CrtU（β-胡萝卜素脱氢酶） | 催化 | 来自Brevibacterium linens，异源表达，催化γ-胡萝卜素生成chlorobactene |
| Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 (CrtO敲除突变体) | 类胡萝卜素合成途径 | crtO | CrtO（β-胡萝卜素酮化酶） | 催化 | 该基因已被敲除，以避免与CrtU竞争底物γ-胡萝卜素 |
| Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 | 类胡萝卜素合成途径 | dxs | Dxs（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶） | 催化 | 内源MEP途径关键酶，在pDCQ140中位于crtU上游，其启动子驱动crtU表达 |
| Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 | 类胡萝卜素合成途径 | crtE, crtB, crtI, crtLm | CrtE, CrtB, CrtI, CrtLm | 催化 | 内源类胡萝卜素合成酶，负责合成γ-胡萝卜素前体 |
关键发现
- pDCQ140中crtU表达仅7%转化γ-胡萝卜素为chlorobactene
- pDCQ143（Cm^r启动子）实现>90%转化。在CrtO敲除宿主中，chlorobactene为主要类胡萝卜素（>90%），而野生型宿主中4-酮基-γ-胡萝卜素副产物至少占10%（摇瓶），发酵中约50%。摇瓶培养基比较：NBYE+1%果糖得到最高总色素产量50.3 μg（200 ml），NBYE单独培养基比色素产量10.9 μg/g湿细胞。10 L补料分批发酵获得370 g湿细胞，最终OD600=45，产chlorobactene约18 mg（约200 ppm），是几乎唯一的类胡萝卜素。分子量差异：γ-胡萝卜素536 Da，chlorobactene 532 Da。
研究结论
成功实现了在Rhodococcus中高效合成chlorobactene，并通过宿主工程和发酵优化获得18 mg产量的纯品，表明Rhodococcus可作为生产芳基类胡萝卜素的有效平台。