Oxygen-limited control of methanol uptake for improved production of a single-chain antibody fragment with recombinant Pichia pastoris
- 作者
- Narendar K. Khatri, Frank Hoffmann
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1007/s00253-005-0306-1
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过氧限制策略控制甲醇摄取速率，在保持恒定甲醇浓度的同时提高单链抗体片段在重组毕赤酵母中的产量
研究策略
采用两种前馈控制策略生成有目的的氧限制：一是延长诱导前甘油补料阶段以增加细胞密度，二是限制空气流速并按指数增加，从而控制比甲醇摄取率至最优范围
核心内容
本研究针对重组毕赤酵母表达单链抗体片段（scFv）过程中甲醇摄取速率难以精确控制的问题，提出了两种前馈氧限制策略：一是在诱导前延长甘油补料阶段以提高细胞密度，二是限制空气流速并按指数递增以控制比甲醇摄取率至最优范围。在延长甘油补料策略中，诱导时细胞密度达245 g/L，产物积累立即开始，比产率稳定在80 mg kg⁻¹ h⁻¹，3天后获得2,500 mg/L scFv；在限制空气策略中，细胞密度为135 g/L，产物积累滞后20 h，但平均比产率达250 mg g⁻¹ h⁻¹，为全通气条件的5至8倍，最终产物浓度达3,500 mg/L。两种策略均将比甲醇摄取率控制在约0.02 g g⁻¹ h⁻¹，且在低至0.16 vvm的空气流量下仍可产生500 mg/L scFv。结果表明，通过简单的空气限制而非纯氧供给即可有效控制甲醇代谢，实现克/升级产物浓度，该策略易于工艺放大，为甲醇营养型酵母中重组蛋白的高效生产提供了实用方案。
创新点
利用有目的的氧限制来控制甲醇摄取，避免了纯氧供应，有利于工艺放大；比较了两种控制模式，均获得克/升级产物；比产率显著提高，最高达250 mg g^-1 h^-1
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | 甲醇诱导表达，催化甲醇氧化为甲醛 |
| Pichia pastoris GS115 | 重组蛋白表达调控 | AOX1启动子 | — | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，驱动scFv基因表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌通路 | α-交配因子分泌信号序列 | α-交配因子前导肽 | 转运 | 来自酿酒酵母，引导scFv分泌至胞外 |
关键发现
延长甘油补料策略中，诱导时细胞密度为245 g/L，产物积累立即开始，比产率恒定在80 mg kg^-1 h^-1，3天后获得2,500 mg/L scFv。限制空气策略中，诱导时细胞密度为135 g/L，产物积累滞后20 h，但平均比产率高达250 mg g^-1 h^-1（原文单位），是全通气条件的5-8倍，最终产物浓度达到3,500 mg/L。两种策略均将比甲醇摄取率控制在0.02 g g^-1 h^-1左右。即使空气流量低至0.16 vvm，仍可产生500 mg/L scFv，但低于最优通气条件（3,500 mg/L）。
研究结论
限制空气供应成功用于控制甲醇摄取，在保持恒定甲醇浓度的同时实现了scFv的高效生产，产物浓度达到克/升级，且避免了纯氧需求，该简单的前馈控制策略易于放大。